DNA重组技术的基本工具(讲课)-副本.ppt

你还记得我们吗？,氢键磷酸二酯键DNA聚合酶限制性内切酶DNA连接酶运载体,选修3,专题1.基因工程的基本内容,基因工程的概念,1.1基因工程的基本工具,1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的发展史,1.3基因工程的应用,1.4蛋白质工程的崛起,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,别名：操作环境：原理：操作水平：结果：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因重组,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。,基因工程的产物,基因工程的概念,1.1基因工程的基本工具,基因工程的发展史,（自学了解）,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫基因),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),转基因棉花植株,上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”运载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”-“分子缝合针”-“分子运输车”-,限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体,1、简称：2、分布：,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要在原核生物中,限制酶,寻根问底(P4),你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,限制酶在原核生物中的作用,思考与探究P7,2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,限制酶的识别特点,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC,（专一性）,3、特点:,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,识别特定核苷酸列,切割特定切点。,（专一性）,切点：,磷酸二酯键,（磷酸二酯键）,EcoR,黏性末端,黏性末端,Goback,中心轴线两侧切开,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,中心轴线处切开,作用：结果：,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,切割DNA,产生黏性未端和平末端,3、特点:,4、作用：5、结果：,1、简称：2、分布：,工具1：限制性核酸内切酶,主要在原核生物中,限制酶,识别特定核苷酸列,切割特定切点,（专一性）,切割DNA,产生黏性未端或平末端,小结,1、作用:,把DNA片段拼接成新的DNA，,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,不是氢键,二、DNA连接酶“分子缝合针”,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶,3、类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端,寻根问底(P6),DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,作用对象,DNA复制,基因重租,4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较,3、类型,E,coli,DNA,连接酶,来源：大肠杆菌,作用特点：只连接黏性末端,T,4,DNA,连接酶,来源：,T,4,噬菌体,作用特点：连接黏性末端和平末端,2、作用原理：,催化磷酸二酯键形成,1、作用:,工具2：DNA连接酶,把DNA片段拼接成新的DNA，,4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较,小结,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究P7,1、载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,2、常用的载体：质粒（最常用）噬菌体的衍生物，动植物病毒等,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因,3、质粒,本质：小型环状DNA分子。,分布：许多细菌、酵母菌等生物,工具3：运载体,1、需要的条件有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上复制有某些标记基因，便于筛选对受体细胞无害2、常用运载体质粒、噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒,小结,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,思考与探究P7,2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。,教材P7思考与探究1,1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,反馈练习：,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,4、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”,审题,5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GCAATTCGCCTTAACGGCGG,(1)其中和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是。,反馈练习：,1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破,2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。,1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.,1957年克里克提出中心法则的确立,3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明,技术发明命使基因工程的实施成为可能,1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.,1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶,1977年科学家又发明了DNA序列分析方法,1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术,4)DNA体外重组的实现,1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.,1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.,1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用,这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验,1973年科恩第一个建成“基因工程菌”，并创立基因工程模式,1973年称这“基因工程元年”，,科恩被称为基因工程发展史上的创始人,科恩并向美国申报了世界上第一个基因