DNA重组 (2).ppt

2019/11/27,1,DNA重组（recombination）是指发生在DNA分子内或DNA分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，是已有遗传物质的重新组合过程。它主要有同源重组、位点特异性重组和转座重组三种形式。作用：生物体通过重组，既可以产生新的基因或等位基因的组合，还可能创造出新的基因，使种群内遗传物质的多样性提高；此外，重组还被用于DNA损伤的修复，而某些病毒利用重组将自身的DNA整合到宿主细胞的DNA上。,2019/11/27,2,2019/11/27,3,由文特尔召集、诺贝尔医学奖得主汉米尔顿.史密斯领导的二十人精英小组首次制出了合成染色体，染色体含有三百八十一个基因、五十八万个basepair的基因密码。,2019/11/27,4,新生命体拥有人工DNA这组染色体的DNA序列基本上参照一种名为生殖支原体(MycoplasmaGenitalium)的细菌。研究员把它的DNA序列简化了五分之一，只剩下足以维持生命的基本部分。,2019/11/27,5,研究小组已把这组染色体植入一个活菌细胞中，成为一个近乎全新的生命体。,2019/11/27,6,这个新生命体的细胞自我复制和新陈代谢的能力，和接受移植的细胞相关。文特尔强调：“我们将从读取基因序列阶段跃升到有能力编写，这将赋予我们做一些从前从未想过的事情的能力。”,2019/11/27,7,制造设计基因组的技术未来可能会带来非常可观的裨益：用来制造人们目前意想不到的替代能源，像纯粹用蔗糖分解的丁烷和丙烷；或者创造出能吸收二氧化碳的细菌，以纾缓全球暖化。,2019/11/27,8,同源重组（homologousrecombination）也称为一般性重组（generalrecombination），它是一种在两个DNA分子的同源序列之间直接进行交换的重组形式。同源重组不依赖于序列，但依赖于序列同源性。,2019/11/27,9,同源重组的发生必须满足以下几个条件：（1）在进行重组的交叉区域含有完全相同或几乎相同的核苷酸序列；（2）两个双链DNA分子之间发生互补配对；（3）需要特定的重组酶的催化；（4）形成异源的双链；（5）发生联会（synapsis）。,2019/11/27,10,图6-1同源重组的Holliday模型,一、同源重组的分子机制,2019/11/27,11,图6-2电镜下的Holliday连接,2019/11/27,12,图6-3同源重组的双链断裂模型,2019/11/27,13,以E.coli为例：（一）RecA蛋白RecA蛋白是同源重组中最重要的蛋白质，参与E.coli所有的同源重组途径。,2019/11/27,14,RecA的主要功能包括：（1）促进2个DNA分子之间的链交换；（2）参与SOS反应作为共蛋白酶（co-protease）促进LexA蛋白的自水解。,2019/11/27,15,图6-4RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换,2019/11/27,16,（二）RecBCD蛋白又称为RecBCD酶，由RecB、RecC和RecD三个亚基组成，具有5种酶的活性，即外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶。,2019/11/27,17,图6-5RecBCD酶的在同源重组中的作用,产生单链DNA，为RecA发挥作用创造条件，由此最终起动了链交换和重组反应,2019/11/27,18,序列是一段特殊的碱基序列，其一致序列是5-GCTGGTGG-3，它的存在能显著提高重组的频率。在重组中的作用是调节RecBCD的酶活性，刺激RecBCD重组途径。据估计，E.coli整个基因组含有1000个以上的序列。,2019/11/27,19,（三）RuvA、RuvB和RuvC蛋白,2019/11/27,20,RuvA、RuvB和RuvC在同源重组中的作用,图6-6RuvC的作用模型,2019/11/27,21,4.其它同源重组蛋白在E.coli中大概有30种蛋白质与同源重组有关，除了上面详细介绍的几种以外，还有：RecE，RecJ，RecQ，RecF，RecR，RecT，RecG，Rus，RecN，SbcA，SbcB，SbcC，SbcD，DNA拓扑异构酶I；DNA旋转酶；连接酶；聚合酶I；DNA解链酶II；DNA解链酶IV；SSB。,2019/11/27,22,E.coli主要有三条同源重组途径，其中的许多成分是SOS-诱导的，这意味着它们在细胞中正常的功能可能是重组介导的DNA修复。用于基因工程的某些菌株其参与重组的基因几乎都无活性，这有利于防止大的质粒之间和质粒与染色体之间发生不必要的重组。,2019/11/27,23,三、E.coli几种重要的同源重组途径,（一）RecBCD途径这是E.coli最主要的重组途径。除了RecBCD蛋白以外，还需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、连接酶和旋转酶。此外，还需要序列.,2019/11/27,24,图6-8RecBCD同源重组途径,2019/11/27,25,（二）RecF途径和RecE途径RecF途径主要是质粒之间进行重组的途径。,2019/11/27,26,四、真核生物的同源重组主要发生在细胞减数分裂前期I的两个配对的同源染色体之间（非姊妹染色单体），先在细线期和合线期形成联会复合体，再在粗线期进行交换。也会发生在DNA损伤修复之中，主要用以修复DNA双链断裂、单链断裂和链间交联等损伤。,2019/11/27,27,2019/11/27,28,如果不发生交换，则减数分裂受阻，以确保在交换发生之前细胞不能分裂。,图6-9真核细胞DNA双链断裂的重组修复,2019/11/27,29,是指发生在DNA特异性位点上的重组。参与重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合。,2019/11/27,30,位点特异性重组的功能包括：（1）调节噬菌体DNA与宿主菌染色体DNA的整合；（2）调节特定的基因表达；（3）调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。,2019/11/27,31,第一例位点特异性重组发现在E.coli染色体DNA和噬菌体DNA之间。噬菌体感染E.coli以后，其DNA通过两端的粘性位点（cos位点）自我环化，并在DNA连接酶的催化下实现共价闭环。随后，噬菌体必须在裂解途径和溶源途径做出选择。,2019/11/27,32,如果选择裂解途径，噬菌体会在较短的时间内通过滚环复制大量增值，并导致宿主菌裂解；如果是溶源途径，噬菌体DNA就以位点特异性的重组整合到宿主染色体DNA上，进入到原噬菌体状态。在这期间，噬菌体几乎所有的基因都不表达。,图6-11噬菌体的位点特异性整合,2019/11/27,34,图6-12噬菌体重组整合或切除时切点的序列,2019/11/27,35,转座重组（transpositionrecombination）是指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的现象。发生转位的DNA片段被称为转座子（transposons）或可移位的遗传元件，有时还被称为跳跃基因（jumpgene）。,2019/11/27,36,与前两种重组不同的是，转座子的靶点与转座子之间不需要序列的同源性。接受转座子的靶位点绝大多数是随机的，但也可能具有一定的倾向性（如存在一致序列或热点），具体是哪一种与转座子本身的性质有关。,2019/11/27,37,转座重组可以导致突变，如果插入到一个基因的内部，很可能导致基因的失活；如果插入到一个基因的上游，又可能导致基因的激活。,2019/11/27,38,图6-14转座子对基因X的可能影响,2019/11/27,39,一、原核生物的转座子人们最早在E.coli内发现转座现象，首先被发现的转座子是插入序列（insertionsequences，IS）。迄今为止，在细菌内已发现四类转座子。,2019/11/27,40,（一）第一类转座子即IS，它们是最简单的转座元件，具有以下特征：（1）长度较小，通常在700bp1800bp之间；（2）两端通常含有10bp40bp长的IR(invertedrepeats)序列；（3）内部一般只有一个基因，其表达产物只与插入事件有关，是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），缺乏抗生素或其它毒性抗性基因；,2019/11/27,41,图6-15第一类转座子的结构,2019/11/27,42,（4）通过“剪切”和“粘贴”的方式进行转座，转座结束后可导致靶位点序列重复（参看图6-16）。（5）有少数（如IS91）没有明显的IR序列，通过滚环复制和粘贴的方式进行转座。,2019/11/27,43,图6-16第一类转座子的转座机制,2019/11/27,44,（二）第二类转座子又称为复杂型转座子，具有以下特征：（1）较长，长度在2.5Kb20Kb之间；（2）两侧含有35bp40bp长的IR序列；（3）内部通常含有不止一个结构基因。常见的结构基因包括：tnpA编码转座酶，tnpR编码解离酶，一个或几个特定的抗生素抗性基因；（4）转座以后导致约5bp长的靶位点序列发生重复，结果导致在转座子两侧产生直接重复序列。,2019/11/27,45,图6-17第二类转座子的结构,2019/11/27,46,表6-2几种第二类转座子的特征,2019/11/27,47,（三）第三类转座子又名复合型转座子（compositetransposon）,2019/11/27,48,图6-18第三类转座子的结构,（四）第四类转座子这一类转座子最为典型的是Mu噬菌体，它是E.coli的一种温和性噬菌体，具有裂解和溶源循环生长周期。在其复制的时候，它通过复制型转位随机插入到宿主DNA的其它区域，很容易诱发宿主细胞的各种突变，因此它有时被称为诱变子（mutator）。,2019/11/27,49,二、真核生物的转座子一般可以根据转座的机理将真核转座子分为二类：第一类是需要RNA中间体的反转座子（retrotransposons）或逆转座子，其转座过程是DNARNADNA，中间有一环节是反转录反应；第二类是无RNA中间体的DNA转座子，其转座过程是DNADNA。,2019/11/27,50,DNA转座子还可以进一步分为复制型DNA转座子保留型DNA转座子,2019/11/27,51,例：玉米的Ac-Ds系统,2019/11/27,52,图6-23逆转座子的转座机制,2019/11/27,53,三、转座的分子机制,2019/11/27,54,图6-26由DDE转座酶介导的转座子三种剪切方式,DNA重组是指发生在DNA分子内或DNA分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，主要包括同源重组、位点特异性重组和转座重组。同源重组是两个DNA分子的同源序列直接进行交换。细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。解释同源重组的模型有Holliday模型、Aviemore模型（单链断裂模型）和双链断裂模型。三种模型在重组过程中形成状的Holliday连接是一致的。同源重组的基本步骤包括：链断裂与切除、链侵入、退火与合成、形成Holliday结构、Holliday连接的分离和交换。,2019/11/27,55,参与E.coli同源重组有关的蛋白质包括：RecA蛋白、RecBCD蛋白、RuvA、RuvB和RuvC蛋白等。RecA蛋白参与E.coli所有的同源重组途径。RecA的主要功能有促进2个DNA分子之间链的交换，以及作为共蛋白酶促进LexA阻遏蛋白的自我水解。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三个亚基组成，具有外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶共五个酶活性。RuvA蛋白能识别Holliday连接，协助RuvB蛋白催化分叉的迁移。RuvB蛋白是一个解链酶，其功能是催化Holliday连接中分叉的迁移。RuvC蛋白是一种特殊的核酸内切酶，催化Holliday连接的分离，因此被称为解离酶。,2019/11/27,56,发生在E.coli的同源重组途径有RecBCD途径、RecF途径和RecE途径。真核生物的同源重组主要发生在细胞的减数分裂的前期I的两个配对的同源染色体之间。同源重组也会发生在DNA修复之中，用以修复DNA双链断裂、单链断裂和链间交联。适合真核生物同源重组的模型应该是双链断裂模型，参与同源重组的主要蛋白质有Rad50、Mre11、Nbs1、Spo11、MSH4、Dmc1、PCNA、RPA和DNA聚合酶/等。,2019/11/27,57,位点特异性重组是指在DNA特定位点上发生的重组，需要专门的蛋白质识别发生重组的特异性位点并催化重组反应。位点特异性重组也发生链交换、形成Holliday连接、分叉迁移和Holliday连接解离。位点特异性重组可以发生在2个DNA分子之间，导致2个DNA分子之间发生整合。位点特异性重组也可以发生在1个DNA分子内部，可能导致缺失或倒位。位点特异性重组的功能包括：调节噬菌体的整合、调节基因表达、调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。,2019/11/27,58,转座重组是指