DNA重组的基本技术.ppt

高中生物选修3现代生物科技专题,专题1基因工程,基础理论和技术的发展催生了基因工程,DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明,？,2.基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？,（1）原核生物的基因结构,1.基因的结构,能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质,非编码区：,编码区,原核细胞基因的结构,RNA聚合酶结合位点：RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚酶结合位点,启动子,终止子,编码区上游,编码区上游,启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,（2）真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA。,内含子:,外显子:,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列,不能编码蛋白质的序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,2基因表达的调控,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(存在葡萄糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与操纵基因结合，结构基因转录受阻,阻抑物,原核生物基因表达的调控,乳糖代谢基因表达调控图解：(只存在乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。,阻抑物,乳糖,转录,半乳糖苷酶,酶,酶,基因工程产品,抗虫害的玉米,转基因鲑鱼,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),资料,位于费城托马斯杰斐逊大学的希拉里和她的同事成功地将人体狂犬病抗体的DNA译码移入烟草作物中。转基因烟草作物可以产生一种人体蛋白质，而这种物质能抗击致命性的狂犬病病毒。,基因工程的定义：,理论基础：,基本原理：,1.不同生物的基因结构上具有一定的相似性：（1）基因的基本单位相同（2）具有相同的碱基互补配对原则（3）都是双螺旋结构,2.不同生物共用一套密码子。,基因重组,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切重组导入表达,人类需要的基因产物,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),抗虫棉(有毒蛋白),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,重组DNA,导入,形成,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,基因工程培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,1.1DNA重组技术的基本工具,关键步骤一的工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）,1.来源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌细胞内可分离出EcoRI限制酶,限制酶在原核生物中的作用,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共同构成细菌的限制修饰体系，起限制外来DNA、保护自身DNA的作用,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）,1.来源：主要来自于原核生物，如：大肠杆菌细胞内可分离出EcoRI限制酶,2.作用：识别特定的核苷酸序列并水解特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。大多数限制酶能够识别的序列均为6个核苷酸（个别4、5、8）,(1)限制酶识别序列的特点,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列。如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC,(2)切点：,与DNA酶有什么区别？,磷酸二酯键,实质：,DNA酶：不特异性识别序列水解DNA,水解产物：,DNA酶：,限制酶：,DNA片段,基本单位脱氧核苷酸,能识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶,限制酶：,重播,3.作用结果：切割DNA分子产生两种类型的末端：黏性末端和平末端,(1)黏性末端,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,(2)平末端在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。,4.举例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开,限制酶,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以重组的DNA分子了。,思考,限制酶的命名第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具有不同特异性的酶,例流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilusinfluenzaed属名种名株系HindIIIIIIHindIHindIIHindIII,限制酶的分类根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为：I型II型III型,1.I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。,功能核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶,2.III型酶与I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。,3.II型酶（1）II型酶的识别识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180的旋转对称性。（2）II型酶的切割功能,5端黏性末端（cohesiveend)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。,黏性末端,3端黏性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3末端切割。,少数有特殊性质的酶异源同工酶（isoschizomer）定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。,HpaII、MspI,同尾酶（isocaudarner)为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。,5GGATCC33CCTAGG5,5AGATCC33CCTAGA5,BamHI,BagII,5GGATCC33CCTAGG5,DNA连接酶,二、“分子缝合针”DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组的DNA分子。,1.作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个重组的DNA分子,DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？,2.作用结果：在切口处催化形成磷酸二酯键。,切口：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口：DNA分子中核苷酸缺失。,切口：DNA5磷酸基与3羟基之间的缝隙,注意：DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。,（1）从大肠杆菌中分离得到：E.coliDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接。（2）从T4噬菌体中分离到：T4DNA连接酶，既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,3.分类（酶的来源）,T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶,T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子连接反应需要ATP提供能量。,外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,导入过程需要运输工具运载体。,运载体的作用有哪些？,作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,作为运载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害;5)载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.,三、基因的载体“分子运输车”,2.载体必须具备的条件：（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；（2）具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；（3）具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）（4）对受体细胞无害（5）载体DNA分子大小应适合,1.载体的作用：（1）将外源基因转移到受体细胞中去。（2）利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,3.常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,4.质粒基因工程最常用的运载体,（2）一般一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个,（1）细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子,（3）质粒的存在对宿主细胞无影响,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,（4）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA（目的基因）插入,（6）质粒的复制只能在宿主细胞内完成,（5）能复制并带着插入的目的基因一起复制