DNA重组技术的基本工具.ppt

基因工程,专题1,烟草,据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,抗虫害的玉米,转基因鲑鱼,基因工程产品,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,通用,基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切拼接导入表达,人类需要的基因产物,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,一、DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,一、DNA重组技术的基本工具,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,一、DNA重组技术的基本工具,DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,思考：,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？为什么？植物呢？原核生物，容易遭到入侵吗？原核生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？,可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,主要来源：原核生物,限制酶的作用特点,作用特点：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开切点：磷酸二酯键举例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开,限制酶的识别序列：,限制酶所识别的序列有什么特点,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,限制酶切割的结果,限制酶,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,黏性末端和平末端,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,DNA连接酶“分子缝合针”,连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。Ecoli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,比较：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,思考：,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,基因的载体“分子运输车”,载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有1-多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害,载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,质粒,质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。,要对天然质粒进行人工改造,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GCAATTCGCCTTAACGGCGG,(1)其中和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是。,反馈练习：,达标练习,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶基因工程常用的受体细胞有（）(1)大肠杆菌（2）枯草杆菌（3）支原体（4