流式细胞术的临床应用.ppt

流式细胞术在临床上的应用,深圳市人民医院临床医学研究中心李富荣,第一部分流式细胞仪（FCM)）工作原理,FCM系统结构,流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电系统、偏转系统数据处理系统：计算机工作站,FCM工作原理流程：,样本（血液实体组织）,单细胞悬液,荧光染料特异染色的样本,上机,细胞单列通过测量区,1.散射光信号2.荧光信号,分离、收集、分析、光信号,细胞理化特性分析图,加入荧光染料,激光激发,流式细胞仪的构造及原理,FCM测量光信号获取与分析,散射光信号前向散射光(FSC)-细胞大小侧向散射光（SSC)-细胞粒度（膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量）FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。,根据FSC-SSC二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)与Mono(R2),R1,R2,根据FSC-SSC二维点图，可以容易的区分出Lym(R3).Gran(R1)与Mono(R2),流式细胞术常用染料及检测波长,荧光染料的发射不同波长,DNA和RNA荧光探针的理化特性,荧光探针分子量结合方式碱基特异性激发锋（nm)发射锋(nm)P1668嵌入无493630EB394嵌入无482616MI1069非嵌入G-C320,445575CA31183非嵌入GC320,445575HO33258624非嵌入AT343480HO33342615非嵌入AT343455DAPI350非嵌入AT5406507-AAD1270嵌入GC540655AO370嵌入(双链）无492530静电（单链）640PY303嵌入(双链）GCAT549-562565-574静电（单链）,细胞周期分析,通过荧光探针对细胞周期进行相对DNA含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNA异倍体,分选系统（Sorting),依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：电荷式分选,稳定液流,测量区,液滴形成,液滴充电,液滴偏转,分选收集,逻辑电路,电荷式分选,通道式分选,稳定液流,测量区,逻辑电路,捕获管,分选收集,第二部分流式细胞术在临床医学中的应用,流式临床应用,淋巴细胞亚群分析,Th1/Th2,肿瘤学,HLA-B27,PNH,四聚体,血小板活化,细胞凋亡,移植免疫,常用淋巴细胞亚群报告模式,深圳市人民医院流式细胞术报告单模式,HLA-B27,通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。,Th1/Th2细胞,肿瘤学,细胞凋亡,移植免疫,四聚体,Tetramer-原理,内源性抗原,外源性抗原,Tetramer-原理,MHCClassI-HLA-A2,Tetramer-原理,Tetramer-原理,国外医学免疫学分册2019；24(2):102-105,HLAClassI限定性肿瘤抗原肽,抗原特异性CTL的分析方法,51Cr释放实验,PCR法,酶联免疫斑点法(ELISPOT),扩增特异T淋巴细胞受体,Tetramer法,间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低，费时费力难以广泛应用,敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测,直接法敏感性高不受TCR基因型的限制,有限稀释法(LDA),用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5%的CD8+细胞对CMV和EBV特异,Tetramer法,DohertyPC.Thenumbersgameforvirus-specificCD8+TcellsJ.Science,2019,280:227,了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命,检测病毒特异性CD8细胞的金标准(GoldStandard),Tetramer-应用,感染性疾病,HIV-AIDS,EBV,CMV,HPV,HBV,HCV,Influenza,Measles,Malaria,TBandRSV,Breast,Prostate,Melanoma,Colon,Lung,Cervical,OvarianandLeukemia,Diabetes,Lymedisease,Multiplesclerosis,Rheumatoidarthritis,Autoimmunevitiligo,EBVandCMV,移植,自身免疫性疾病,肿瘤,感染性疾病,Tetramer-应用-例证,含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者,用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞用Tetramer分离，富集,GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败-HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果HLA-A2/pp65Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力,移植,肿瘤,第三部分定量流式细胞术,定量流式细胞术的概述,定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义。,血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit,特点,可定量与血小板相关的任何抗原(如CD41,CD61,CD42a等)免洗间接法一抗亚型为IgG1,IgG2a或IgG2b定量范围宽(500-90,000分子/血小板)定量准确，CV值(变异系数)小,血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit,标准曲线,血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit,结果,血小板表面抗原定量-PLATELETCalibratorKit,CD41/61复合物变形与Firbrinogen结合，为初期血栓形成的关键步骤,PLATELETFibrinogenKit,应用,心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等)监测抗凝集治疗(如RepPro,Integrelin,Plavix,Ticlid等)检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能力,血液体外(invitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力血小板活化状态(exvivo),标本处理,PLATELETFibrinogenKit,白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit,特点,可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3,CD4,CD55,CD59等)单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数)多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+T细胞上CD28分子数)全血和分离的细胞(如细胞株等)均可间接法一抗亚型为IgG1和IgG2a定量范围宽(1000-300,000分子/白细胞)定量准确，CV值(变异系数)小,白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit,标准曲线,白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit,结果,白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTMCalibratorKit,BloodDendriticCellEnumerationKit,DC作用：1.树突状细胞（dendriticcell,DC）为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与MHC二类分子结合向其它免疫活性细胞传递抗原信息。2.骨髓样DC（MDC）和淋巴样DC(PDC).在诱导和调控免疫应答方式上完全不同：首先它们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反应，即使受到相同的抗原刺激。骨髓样DC（MDC）与Th1效应相关,而淋巴样DC（PDC）与Th2效应有联系；已经应用的领域包括：1）SLE病人病情和疗效观察；2）AIDS病人免疫机能分析；3）病毒性肝炎病人免疫状况研究；4）疫苗研究。,特点,简便、快捷、绝对计数,DC亚群数/ml,最新技术计数血液中循环内皮细胞的标准方法,循环内皮细胞(CEC)增加于,CELLQUANTFF-CD146,急性冠状动脉综合征血小板减少性紫癜镰刀细胞贫血败血症狼疮,肾病综合征器官移植排斥手术创伤癌症,传统方法,显微镜检，手工计数。费时，费力，无法标准化,新技术新标准,CELLQUANTFF-CD146,免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合仅需1mL血整个过程不到1个小时灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞重复性好，室间差(InterlaboratoryCV)小,方法,CELLQUANTFF-CD146,将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL血孵育富集的CD146+细胞用以下试剂染色PI(碘化丙啶)(确定有核细胞)CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰)CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点)标准浓度微球(用于绝对计数)流式分析(循环内皮细胞鉴定)有核细胞(PI+);CD45-;CD146+;前向散射角(FSC)范围宽,CELLQU