基因表达调控与重组DNA技术.ppt

,第十三-十五章基因表达调控及重组DNA技术,2,主要内容,基因及基因表达调控相关概念原核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理,负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。,基因（Gene）,基因组（Genome）,来自一个遗传体系的一整套遗传信息,原核：单个环状染色体所含的全部基因,真核：一个生物体的染色体所包含的全部DNA，又称染色体基因组,线粒体基因组叶绿体基因组,HumanGenome,人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）,1985年美国提出计划投入30亿美元，15年完成1990年正式启动英、法、德、日、中国等先后加入,中国的任务：人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序，该区域约占人类整个基因组的1。,年10月启动2000年6月完成草图2001年2月nature公布草图Nature,409(6822):860-921,20012004年10月nature公布精度99%的测序图人类基因数：2-2.5万Nature,431(7011):931-945,2004,HGP的进展,Thepost-genomeeraiscoming,谱主为生物学大师耗资200万完成盼未来降价普及助提早预防疾病,“生命天书”首份个人基因图公布(2007.5.30),JamesWaston,基因表达调控,是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。,重组DNA技术,本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。,主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理,10,第一节基因表达调控,11,一、基因表达的概念*,在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,简单定义：转录翻译,广义：包括rRNA、tRNA的表达,13,二、基因表达调控的意义,生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约25基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。,通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。,基因表达调控的意义：,14,三、基因表达的规律*,阶段特异性（时间特异性）,组织特异性（空间特异性）,15,阶段特异性（时间特异性）,甲胎蛋白,某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，称时间特异性*多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定时间顺序开启和关闭，称阶段特异性*,哺乳类nAChR：胚胎型2(烟碱型乙酰胆碱受体)成年型2,16,组织特异性（空间特异性）,在个体生长的某一阶段，不同细胞有不同基因表达,A,B,17,四、基因表达的方式,有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为管家基因。这类基因的表达称为基本的基因表达*。,例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因,基本的基因表达也是在一定机制控制下进行,（一）基本的基因表达,18,（二）可调节的基因表达,与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低,又称适应性表达；又称奢侈基因。特点：不是细胞生命必不可少的表达受外环境的影响较大，不恒定表达有间断性和空间特异性,诱导基因表达水平在特定环境中增高的现象这类基因叫可诱导基因,阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫可阻遏基因,DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏,20,五.基因表达的多级调控,基因表达调控在多级水平上进行,21,六、基因表达调控原理,以mRNA转录为例,DNA元件调节蛋白RNA聚合酶活性,*调控要素,（一）转录起始调节基因表达,（1）DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列,操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组件所构成的一个转录单位。,操纵子,调节序列,编码序列：编码蛋白质,启动序列：结合RNA聚合酶,操纵序列：结合阻遏蛋白,*,1、原核生物,操纵子结构,原核生物启动序列（启动子）,（2）调节蛋白,特异因子决定RNA聚合酶特异识别并结合启动序列的能力（因子）阻遏蛋白与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性（负性调节）激活蛋白促进RNA聚合酶活性（正性调节）,（3）RNA聚合酶活性,DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节作用最终由RNA聚合酶活性体现。启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对RNA聚合酶活性影响最大。,2.真核生物,（1）顺式作用元件：（2）反式作用因子：（3）mRNA转录激活及其调节,28,第二节原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理,29,一、原核基因表达及其调控的特点,1、转录与翻译两过程紧密偶联,3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导的负性调节*,2、普遍存在操纵子调节机制,阻遏蛋白,操纵序列,结合,阻遏,解聚结合,去阻遏阻碍,4、转录产物为多顺反子mRNA,5、转录起始是基因表达调控的最关键环节*,多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联，转录产物在一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链,31,二、操纵子理论,通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因（26个，甚至更多），还有其它调节序列。,操纵子结构,32,乳糖操纵子调节机制,阻遏蛋白的负性调节CAP的正性调节协调调节,乳糖操纵子结构,1.阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）*,阻遏蛋白与O序列结合,抑制转录,lac操纵子关闭,阻遏蛋白,mRNA,RNA聚合酶,诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，lac操纵子开启,乳糖,别乳糖,mRNA,阻遏蛋白的负性调节（有乳糖）*,CAP:分解代谢基因激活蛋白catabolitegeneactivatorprotein,2.CAP的正性调节（无葡萄糖）*,cAMP,CAP蛋白,mRNA,CAP的正性调节（有葡萄糖）*,cAMP,CAP蛋白,mRNA,有葡萄糖，cAMP浓度低,cAMP与CAP结合受阻,转录活性下降,阻遏蛋白,mRNA,RNA聚合酶,3.阻遏蛋白与CAP的协调调节*,（1）无乳糖时,阻遏蛋白封闭转录，CAP无作用,（2）有乳糖时,乳糖操纵子去阻遏,虽可转录,但活性很低,必须由CAP的正性调节来加强,mRNA,乳糖操纵子强的转录活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖,42,（一）真核基因结构特点,1.转录产物为单顺反子一个基因一条mRNA一条多肽链,2.重复序列高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列,3.基因不连续性非编码序列内含子,1,2,3,5,3,三、真核基因表达调控,（二）真核基因转录特点,活性染色体结构变化对核酸酶敏感、甲基化程度降低、组蛋白乙酰化修饰,2.正性调节占主导真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用,3转录与翻译分隔进行转录在核内进行，翻译在胞浆进行,44,转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用,1、顺式作用元件：2、反式作用因子：3、mRNA转录激活及其调节,（三）真核基因转录激活调节,1.顺式作用元件*,指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称顺式作用元件。根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。,46,真核生物,顺式作用元件,47,RNA聚合酶II启动位点周围一组转录控制组件,常见组件：TATA盒（TATAAA）-25bp-30bpGC盒（GGGCGG）CAAT盒（CCAATC）,转录起始点,-30bp-110bp,启动子promoter,增强子*：远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距离无关。,抑制子*：对启动子转录活性起抑制作用的DNA序列负性调节元件,2、反式作用因子（转录因子）,转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白,基本转录因子转录激活因子转录抑制因子,绝大多数转录因子属于反式作用因子*,真核生物：,由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。,A,B,RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子,基本转录因子,转录激活因子（正性调节因子）通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起正性调节作用的转录因子。,转录抑制因子（负性调节因子）通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起负性调节作用的转录因子。,与增强子结合的转录因子,与抑制子结合的转录因子,54,真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子TFIID识别并结合启动子，形成TFIID启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。,3mRNA转录激活及其调节,55,第三节重组DNA技术,基因重组（geneticrecombination）,自然发生的基因重排真核、原核均会发生基因变异、物种演变、生物进化的基础,57,克隆*(名词)：就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合。克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。,二、重组DNA技术相关概念,母本,克隆,clone,cloning,（一）克隆与克隆化,细胞克隆：从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞，经扩增获得这样一类相同的细胞。,在分子生物学领域所说的分子克隆专指DNA克隆(DNAcloning)。,分子克隆：从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。,59,（二）重组DNA技术*,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的DNA）与载体DNA连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。,目的DNA,载体DNA,连接,复制子（重组DNA）,导入宿主细胞（转化或转染）,转化子细胞,转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA,62,（三）工具酶,限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶反转录酶多聚核苷酸激酶,限制性核酸内切酶*,识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。,限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别DNA的回文序列*。,HpaI：5-GTTAAC-33-CAATTG-5,平端,PstI：5-CTGCAG-33-GACGTC-5,3突出粘性末端,EcoRI：5-GAATTC-33-CTTAAG-5,5突出粘性末端,（四）目的基因targetgene,cDNA(complementaryDNA)在体外以RNA（通常为mRNA）为模板，经反转录合成的单链DNA。,基因组DNA(genomicDNA)代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,目的基因又称外源DNA,66,携带外源DNA，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒噬菌体DNA病毒DNA,质粒（1）双链环状DNA，细菌染色体外（2）2-3kb或数百kb（3）独立自主复制，稳定遗传（4）遗传标志,(五)基因载体（克隆载体）,67,三、重组DNA技术的原理与基本过程*,1.获取目的基因2.选择、构建基因载体3.目的基因与载体连接，形成重组分子4.重组分子导入受体细胞5.筛选、扩增6.表达目的基因,+,载体,目的基因,重组DNA分子,细菌,转化或转染,扩增,筛选,69,（1）化学合成,（4）PCR,（2）基因组DNA文库,（3）cDNA文库,1.获取目的基因,组织或细胞染色体,限制性内切酶,多个DNA片段,载体,多种转化子（基因文库）,重组DNA,导入宿主细胞,71,聚合酶链式反应（PCR）,在有特定模板、特异DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在时，向DNA合成体系内加入耐热的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶*），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。,变性：解开模板双链DNA95,退火：使引物与单链模板DNA结合55,延伸：DNA链的合成72,2.克隆载体的选择与构建目的基因不能自我复制,5.重组体的筛选,（1）直接选择法抗药性标志选择amprtetrkanr标志补救互补分子杂交,（2）非直接选择法常用免疫学方法特异性强、灵敏度高,6.克隆基因的表达,常见表达体系：（1）原核大肠杆菌（简单、迅速、经济）缺点：无转录后加工适于表达cDNA无翻译后加工无糖基化修饰包涵体,（2）真核酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞,表达有生物活性的蛋白质,76,四、重组DNA技术的应用,1.疾病基因的发现,镰刀形红细胞贫血,脆性X综合征(FMRI基因沉默),2.生物制药,利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。如生产干扰素、胰岛素、细胞因子等。,3.DNA诊断,DNA诊断又称基因诊断，是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因置换