基因重组和基因工程 (2).ppt

基因工程与基因体外表达GeneticEngineeringandgeneexpressioninvitro,第13章,重组DNA技术的发展史,1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子,1997年,动物克隆:克隆羊多莉,1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS),1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验,2001年，人类基因组计划,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。,DNA克隆,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,重组DNA技术基本原理,基本原理,第一节基因克隆是利用工具酶进行操作,工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease),限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,、（基因工程技术中常用型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,II型限制性核酸内切酶：能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,同尾酶,限制性内切核酸酶,重组DNA技术中常用的工具酶,第二节基因克隆需要特定的载体,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准：,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,质粒(plasmid),特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,DNA,Proteincoat,cos,cos,Nonessentialregion,Long(left)arm,short(right)arm,ExogenousDNA(20-23kb),phage,12bp,替换型载体（取代型载体）,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(20kb)高感染效率(109转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍),e.g.EMBL3,DASH,凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb,3.粘性质粒(cosmid):适合克隆大的DNA片段,柯斯质粒载体的特点具有噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。,4.病毒载体,病毒载体,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；2、复杂的装配过程由细胞完成；3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,常用的病毒载体的特点：,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,5.其他,表达载体,指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。,原核表达载体,在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表达元件。,原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有：Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的双启动子)、PL(噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。,真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,选用质粒（最常用）做载体的4点要求：选分子量小的质粒，即小载体（11.5kb）不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr。,第三节基因克隆的过程,1、制备目的基因和相关载体2、将目的基因和有关载体进行连接3、将重组本DNA导入受体细胞4、DNA重组体的筛选和鉴定5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,以质粒为载体的DNA克隆过程,化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),一、目的基因序列的来源和分离,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,人工化学合成法使用于：,较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,cDNA文库将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。,从cDNA文库获取目的基因,聚合酶链式反应（PCR）TA克隆系统由Invitrogen公司（SanDiego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。,二、载体的选择与制备,噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。,三、重组体的连接,1、粘性末端的连接2、利用人工接头连接3、加入同聚物尾连接4、平端连接,方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,粘性末端连接,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),四、重组DNA导入受体菌,将重组体DNA分子导入宿主细胞,1、转化指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2、感染以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。,3、转染指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。,CaCl2处理,直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,五、重组体的筛选,转化后的克隆群体：,1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA,(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue),(插入失活法)抗药性标记选择,目录,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目录,若克隆基因的表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救.,互补的检测,目录,2、免疫学方法利用特异性抗体检测表达产物,3、核酸杂交法筛选特定DNA,鸡的肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法,目录,原位杂交,目录,Southern印迹,目录,4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA,hMLCK重组质粒酶切图谱分析1未酶切质粒2.EcoR酶切3.Hind酶切4EcoR/Hind双酶切5.250bpDNALadder,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,第四节真核细胞基因转染,磷酸钙共沉淀法电穿孔法DEAE-葡聚糖法脂质体法显微注射法,1、利用TK-细胞突变株进行筛选,转染细胞利用抗性标记筛选,TK-细胞,TK+细胞,HAT培养液,不能存活,能存活,A：氨基蝶呤是核苷酸从头合成的抑制物，H：次黄嘌呤可以作为补救合成dATP、dCTP的底物T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。,2、药物筛选：新霉素抗性基因G418是一种氨基糖苷类抗生素,它的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素。当neo基因（新霉素抗性基因）被整合进真核细胞DNA后,获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶,使细胞获得抗性而能在含有418的选择性培养基中生长。,第五节利用重组DNA技术可对基因进行改造,基因定点诱变指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程,称为基因定点诱变.1、通过基因定点诱变可以改变蛋白质编码序列的个别密码子，可以改造蛋白质的结构与功能；2、通过改变具有调控功能的序列，可以确定DNA特定的功能区域；3、构建新的载体或嵌合基因。,一、带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变,二、Kunkel法,三、PCR技术适合进行基因的定点诱变,利用基因定点诱变可改变基因工程蛋白的特性,自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了改变，但仍能保存其原有生物活性。同时一些蛋白质相互融合后仍保持各自成分的活性。因此，通过基因突变而引起蛋白质结构与功能的改变是可行的。,、定点诱变可制备长效胰岛素,将人胰岛素链27位的Thr改为Arg，将链羧基端氨基化和链位Asn改为Gly后，其胰岛素的等电点从5.4移至6.8，在生理pH条件下结晶，从而延迟吸收其在血浆中的半衰期可延长至35.3小时,、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素,胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后1.5至2小时，体内胰岛素还未达到高峰，而且在3-5小时后，其水平仍继续上升。决定胰岛素在注射部位吸收速度决定于胰岛素结合状态。胰岛素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。研究发现多聚体之间形成与其B链的B8、9、12、13、16、23-28位残基有关，因此通过基因突变改变上述位置的氨基酸残基，可减少多聚体形成，提高吸收率。,3、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力,通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基酸残基的组成，会增加其与受体的亲和力。,第六节克隆基因在适当宿主细胞内表达,一、在大肠杆菌表达系统,（一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需要一些基本要素1、来自真核细胞目的基因需要改造2、必须选择用大肠杆菌载体3、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白和非融合蛋白两种（Nde：CATATG；Nco：CCATGG）4、选择适当的受体菌株和诱导条件,1、融合蛋白较稳定；2、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生分泌型产物；、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层析，便于纯化；、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的蛋白酶切位点，可切除原核部分。,表达融合蛋白优点：,（二）、提高外源基因表达水平1、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整SD序列与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性2、将细菌生长与外源基因的表达在时间上分开：减轻细胞的代谢负荷3、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白；,二、真核表达系统,利用真核细胞作宿主表达系统的优点是：真核细胞能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的mRNA。真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。,真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题：选择标记及选择系统只有少数几个；转化效率低，一般只有10-610-4；外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都还不能控制；细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时。此外，细胞大量培养还有不少问题，而且成本较高，利用培养细胞方式大量生产某些表达蛋白，从工艺到成本都要很好地考虑。,受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,(插入失活法)抗药性标记选择,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫学方法,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)；很难表达大量可溶性蛋白。,1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用),大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转