重组DNA技术 (4).ppt

第二十章,重组DNA技术,recombinantDNAtechnique,第一节重组DNA技术的基本过程,重组DNA技术：又称DNA克隆或基因克隆应用酶学的方法，在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。,克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。重组DNA(recombinantDNA,或嵌合DNA,chimeraDNA)：采用克隆技术，把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。,重组DNA技术的基本过程,第二节重组DNA技术中常用工具酶,一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶四、其它修饰酶,1.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)基因工程的手术刀,功能：,识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生黏性末端或平末端。,根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。,作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类：、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,作用模式图：,（1）产生5突出黏性末端(stickyend),EcoRI,作用模式图：,（2）产生3突出黏性末端,PstI,作用模式图：,（3）产生平末端(bluntend),AluI,同裂酶来源不同但能识别相同序列的酶，又称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端，称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,可变酶识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。此类酶是型限制酶的特例。如：BstpGGTNACC;BblGCC(N)4NGGC,2.DNA连接酶(DNAligase)基因工程的缝纫针,将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。,功能：,催化两条双链DNA分子的互补黏性末端或平末端的5磷酸基团与3羟基形成磷酸酯键。,也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。,DNA连接酶催化平末端连接要比黏性末端效率低得多。,DNA连接酶有T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶,DNA连接酶,EcoRI,DNA连接酶,作用模式图：,（1）连接黏性末端,作用模式图：（2）连接平末端,AluI,DNA连接酶,能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用类型：大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段TaqDNA聚合酶反转录酶,三、DNA聚合酶,四、其它修饰酶,末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,功能：,催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。,(1)底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA。,OH,5,3,Mg2+,dNTP,5,3,(A、G、C、T)n,nppi,5,3,OH,Mg2+,dNTP,nppi,5,3,(A、G、C、T)n,末端转移酶,(2)底物是平端或3凹端的双链DNA。,5,3,Co2+,dNTP,5,3,(A、G、C、T)n,nppi,5,3,Co2+,dNTP,nppi,5,3,OH,OH,(A、G、C、T)n,用途：,（1）主要作用是在载体或目的基因3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。,（2）DNA3末端的同位素标记。,重组DNA技术中常用的工具酶,目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。载体（vector）指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具,第三节重组DNA技术中常用载体,作为基因工程载体所需具备的基本条件,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA；拷贝数高具有较高的遗传稳定性,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。,表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。,质粒载体：最常用的对目的基因克隆,噬菌体：主要用于构建基因组DNA或cDNA文库,M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA测序,粘粒：用于克隆大片段DNA,酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白,病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物毒，用于在真核细胞中表达目的蛋白,基因工程载体的种类和用途,1.质粒(plasmid)载体,细菌培养,质粒扩增并表达蛋白质,大肠杆菌,染色质,质粒,细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。,Ampr,ORI,Tetr,pBR322质粒：一种克隆质粒,ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。,结构与功能：,Ampr,Tetr：,两个抗性基因用于筛选阳性克隆。,PstI,BamHI：,两个单酶切位点用于插入目的基因,分子量较小,拷贝数较高,pUC18/pUC19,MCS：MultipleClonningSite,提供多个单酶切位点用于克隆操作,LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆,2.噬菌体(phage)载体,噬菌体(phage),M13噬菌体,粘粒(cosmid),3.人工染色体载体,YAC可接受100kb2000kb的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体包含的调控元件：着丝粒、端粒、复制起始点、限制性酶切位点、选择标记、原核序列及调控元件,4.病毒载体,目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类反转录病毒载体（整合型）腺病毒载体（游离型）,第四节目的基因的获得和体外重组,一、目的基因的获得-分二、目的基因的体外重组-切、接,目的基因(targetDNA),cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA),目的:分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,种类：,（一）化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列（二）聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（三）从基因文库中筛选,（一）目的基因的获取分,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,基因组文库：G-文库,cDNA文库：c-文库(常用),方法：,基因文库,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,（三）外源基因与载体的连接接,1.黏性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平末端连接适用于：限制性内切酶切割产生的粘端补齐或切平形成的平端,3.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目录,4.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5.T-A克隆是直接将PCR产物插入到载体中的方法。,第五节重组分子的导入和筛选与鉴定,一、重组DNA分子的导入转二、重组DNA分子的筛选与鉴定筛,一、重组DNA分子的导入,宿主细胞应具备的条件处于感受态对载体无严格限制限制酶和重组酶缺陷不对外源DNA进行修饰能表达重组体所提供表型特征,导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),磷酸钙转染DEAE-葡聚糖介导转染电穿孔转染脂质体转染显微注射,非转化子,转化子,非重组子,重组子,鉴定,单抗生素筛选,非转化子(不能生长）,转化子,阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体,二、重组DNA分子的筛选与鉴定,直接选择法抗药性标记选择标志补救(markerrescue)分子杂交法原位杂交Southern印迹免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,重组子的筛选与鉴定方法,Ampr,Terr,插入失活:例1：在Tetr中插入目的基因,在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。,Amp,Tet,123,456,3和5是阳性克隆,123,456,例1：,X-gal,蓝色化合物,-半乳糖苷酶,Lac-Z基因,例3：蓝白斑筛选,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组DNA技术操作的主要步骤,第六节外源基因的表达,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程,一、外源基因在原核细胞中的表达,原核表达系统主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等，其中大肠杆菌（E.coli）表达体系最为常用，其优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产,（一）对外源目的基因的要求,1外源真核基因不能带有5端非编码区和内含子结构，必须用cDNA或化学合成基因2外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列等元件控制下3重组载体必须形成正确的开放阅读框架4外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有效翻译，所表达的蛋白质产物稳，不能对宿主菌有毒害作用,（二）对原核表达载体的要求,1具有强启动子及其两侧的调控序列2含有SD序列，而且SD序列与起始密码子AUG之间要有合适的距离3带有转录终止序列4含多接头克隆位点,（三）外源基因在原核细胞中的表达,1.融合型表达蛋白2.非融合型表达3.分泌型表达4.包含体,（四）原核表达系统的不足,只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在难以实现大量表达分泌性蛋白真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素,真核表达系统是指在真核细胞中表达外源基因的体系主要有：酵母、哺乳动物、昆虫细胞（杆状病毒）系统和高等植物系统,二、外源基因在真核细胞中的表达,（一）真核表达系统的优缺点,优点：可表达克隆的cDNA或真核基因组DNA可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中缺点：操作技术难、费时、费钱,（二）真核表达载体,真核表达载体大多是穿梭载体，既含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和MCS等序列，利于在原核细胞中进行目的基因的重组和载体的扩增；又含有