药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法验证,第一节定量分析样品的前处理方法,一、概述,有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固，如醋酸苯汞、汞撒利,含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物。,例：酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠,处理方法主要分为两大类:不经有机破坏的处理经有机破坏的处理,二、不经有机破坏的分析方法,(一)直接测定法金属原子不直接与碳原子相连的含金属有机药物,某些CM键结合不牢固的有机金属药物例：富马酸亚铁的含量测定。,(二)经水解后测定法,1、碱水解后测定法适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素和脂肪碳链相连。,加NaOH，加热回流,含有机结合的卤素,间接银量法测定,有机药物,方法原理：,药物水解,无机的卤素离子,例：三氯叔丁醇的含量测定,2、水解后测定法例：硬脂酸镁的含量测定,定量、过量,2NaOH+H2SO4,Na2SO4+2H2O,MgSO4+2C17H35COOH,过量剩余,(三)经氧化还原后测定法,例：泛影酸、胆影酸等的含量测定,1、酸性或碱性还原后测定,卤素结合在芳环上,例：含锑药物,具有氧化性,2、利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量利用药物中可游离出的金属离子的氧化性，在酸性溶液中氧化碘化钾，析出碘，再用硫代硫酸钠滴定析出的碘，以测定含量。,三、经有机破坏的分析方法,适用于金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物，使有机结合状态的金属及卤素转变为可测定的无机化合物，再选用适当的方法测定。,（一）湿法破坏（1）硝酸-高氯酸法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏,干法灼烧法,（2）硝酸-硫酸法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。不能用于含碱土金属有机药物的破坏,（3）硫酸-硫酸盐法,加入浓硫酸作为氧化剂,加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。,用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态,注意点：,破坏操作要放在通风橱中进行,试剂不含有被测金属离子或干扰测定的组分,做空白试验,破坏在凯氏燃烧瓶（硅或硼玻璃）中进行,(二)干法破坏1、高温炽灼法目的：将有机物灼烧灰化以达分解的目的,适用范围：湿法不易破坏完全的有机药物，以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物,限制：对于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物不适用,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下（2）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去,2、氧瓶燃烧法：氧瓶燃烧法：将有机药物放在充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，有机结构部分分解为CO2和H2O，用适当的吸收液吸收燃烧所产生待测物质（已转化为不同价态的氧化物）,然后根据待测物质的性质,然后采用相应的方法进行鉴别、检查或测定.,特点：适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,（1）仪器装置燃烧瓶一般为不同体积的磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞严密、空心、底部熔封一根直径为lmm铂丝，铂丝下端是网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3,样品制备：称样用材料及称样方法无灰滤纸：用于固体样品,纸袋：适用于液体样品,吸收液A.作用：将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为便于测定的价态,B.吸收液的选择,、操作方法A、固定已称好样品的无灰滤纸或纸袋,B、燃烧瓶中加入规定量及种类的吸收液,C、用水把瓶口湿润，小心急速通入氧气，立即用表面皿盖好,D、点燃滤纸或纸袋尾部，迅速放入装有吸收液的燃烧瓶中，拧紧瓶盖，用少量水封口,E、待燃烧完全、无黑色碎片后，充分混合，使生成的烟雾被完全吸收后，放置15分钟，再用少量水冲洗瓶塞和铂丝，合并洗液和吸收液。用同样的方法作空白试验,（2）注意事项按规定方法操作根据供试品的取用量选择不同的燃烧瓶,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中防止爆炸的可能性,燃烧瓶要洁净，不能残留有机溶剂，不能用有机润滑剂涂抹瓶塞要有防爆措施氧气要充足，确保燃烧完全，产物不能有黑色炭化物燃烧产生的烟雾要被完全吸收充分振摇和放置都是为了保证吸收完全例：碘产生紫色烟雾；氯、氟产生白色烟雾，烟雾颜色完全消失后，即表示吸收完全测定含氟有机化合物时要用石英燃烧瓶,4、应用含卤素、硫、磷、氟及硒等有机药物的鉴别、杂质的检查及含量测定例碘苯酯的含量测定ChP（2005）原理碘苯酯为有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液（氢氧化钠），生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,碘苯酯（有机碘化物）,氧瓶燃烧,碘化物,氧化,碘化物与碘酸盐,游离碘,紫色烟雾,氢氧化钠吸收液,加溴-醋酸液,碘酸盐,过量，以甲酸及通空气除去,碘化钾,游离碘,硫代硫酸钠,淀粉,终点蓝色消失,溶液中,要标定,例：氧瓶燃烧法中的装置有：磨口硬质玻璃锥形瓶B.磨口软质玻璃锥形瓶C.铂丝D.铁丝E.铝丝,例：选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气E.无灰滤纸,第二节定量分析方法的特点,一、容量分析法（一）特点原理：aA+xXcC+dD,标准溶液,被测物质,容量分析的化学反应必须满足的条件：（1）反应要有一定的化学计量关系，并且要能定量地完成（2）反应速度要快，即反应在瞬间完成（3）必须要有合适的确定滴定终点的方法滴定分析法:酸碱滴定法;沉淀滴定法配位滴定法;氧化还原法；非水溶液滴定法等,（二）计算1、滴定度的定义滴定度：指每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的量，以T表示，中国药典以mg表示例：每1ml的盐酸滴定液（0.5mol/l）相当于72.06mg苯甲酸钠,2、滴定度（T）的计算aA+bBcC+dD,待测物,滴定液,式中：m滴定液的摩尔浓度，mol/lM-待测物的毫摩尔质量（分子量）a、b分别为被测物、滴定液的摩尔数,定义,3、含量计算（1）直接滴定法,实际滴定度（或校正滴定度）T的计算T=T*F其中,每1ml标准溶液相当于被测物质的量,(2)间接滴定法1）生成物滴定法计量滴定液消耗的量，计算供试品的含量计算同直接滴定法,2）回滴定法（剩余滴定法）原理：先在待测样品溶液中加定量、过量的滴定液A，使它和样品反应，等反应结束后，再用另一种滴定液B来回滴剩余的滴定液A。不做空白的含量计算,特点：A、B两种滴定液均需标定,做空白的含量计算方法,特点：仅需标定滴定液B的浓度,例1：酸碱滴定法测定烟酸片含量。取本品（规格：0.1g/片）10片，精密称定为1.5840g，研细，精密称取片粉0.3329g,（约相当于烟酸0.2g），加新沸过的冷蒸馏水50mL，置水浴上加热，并时时振摇，使烟酸溶解后，冷却至室温，加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1005mol/L)滴定，消耗16.90mL。1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于12.31mgC6H5NO2。问：本品是否符合中国药典规定的含量限度（中国药典规定，本品含C6H5NO2应为标示量的95.0%105.0%),二、光谱分析法紫外可见分光光度法1、比耳朗伯定律（BeerLambert定律）A=E*C*LBeer定律说明吸收和浓度的关系Lambert定律说明吸收和厚度的关系吸收系数：一定波长下，溶液浓度为1mol/l，液层厚度为1cm时，物质的吸收度-定性依据104，物质有强吸收102104，物质具有中等强度吸收100，物质有弱吸收,：一定波长下，溶液浓度为1%（W/V），液层厚度为1cm时，物质的吸收度-定量依据两者间的关系：或,2、对溶剂的要求溶剂的截止波长：使用范围不能小于截止使用波长溶剂的纯度：检查所用溶剂在检测波长处是否符合要求,3、含量测定测定要求:空白对照：配制供试品溶液的同批溶剂吸收池：1cm石英吸收池吸收波长：该品种项下规定波长2nm之内吸收值:0.30.7(0.20.8),（1）对照品比较法供试品的浓度为：,原料药：,（2）吸收系数法按规定方法配制供试品，在规定的波长及吸收厚度下，测定吸收度，计算再按在相同条件下，标准对照品测到的计算含量：,注意：此法对仪器要求高，必须注意校正和检定吸收系数100,（3）计算分光光度法一般不宜用作含量测定（当测定波长处于吸收曲线陡升或陡降部位时，对测定影响大）（4）比色法供试品本身无吸收或有吸收但干扰大，可加入适当的显色剂后测定。此法影响因素较多，实验平行操作,例：对照品比较法测定卡马西平含量。精密称取本品0.0503g,置100mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，精密量取2mL，置100mL量瓶中，加乙醇稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取卡马西平对照品适量，用乙醇制成1mL中含10.3g的溶液，作为对照品溶液。取上述两种溶液，用1cm吸收池在285nm波长处测定，测得供试品溶液吸光度为0.435，对照品溶液A值为0.440。问本品是否符合中国药典规定的含量限度（中国药典规定，本品按干燥品计算，含C15H12N2O应为标示量的97.0%103.0%),三、色谱分析法,（一）高效液相色谱法1、对仪器的一般要求固定相种类流动相组成：注意：使用C18时，流动相中含有的有机溶剂比例应不低于5检测器药典中规定的固定相种类、流动相组成及检测器类型不能随意改变,2、系统适用性试验试验指标：理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子（1）色谱柱的理论塔板数(n)（2）分离度(R)注意：峰宽的概念（3）重复性：5次连续进样，RSD应不大于2.0,（4）拖尾因子（T）用峰高法定量：0.951.05用峰面积法定量：,3、测定法（大多数采用峰面积法）（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量按各品种项下的规定，精密称取（或量取）药物对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取中在所配溶液，配制成测定校正因子用的药品对照品（含内标）进样，记录谱图，得峰高（H）或峰面积（A）,R表示药物对照品S表示内标物,配制含有内标的供试品溶液，进样，记录谱图，得峰面积（或峰高）,特点：如果在配制测定校正因子和供试品溶液时用同一份内标物溶液，内标物质不必精密称定或量取。,内标物不易寻找,2、外标法测定供试品中主成分含量两种方法：标准曲线法和单点外标法（1）标准曲线法,注意两点：理论上讲标准曲线应该过原点，但由于存在系统误差，会偏离原点，即A=aCX+b如果供试品为片剂，则含量应该为标示量的百分含量，计算方法为,（2）单点外标法：,特点：简单，但要求进样量准确，操作条件稳定,(二)气相色谱法,1、对仪器的一般要求色谱柱种类：毛细管柱或填充柱载气：氮气检测器：氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，不得低于150度药典中规定的固定液品种、检测器类型及特殊指定的色谱柱材料不能随意改变,2、色谱系统适用性试验：3、测定方法（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量（2）外标法测定供试品中主成分含量（3）标准加入法测定供试品中主成分含量,精密称取待测成分对照品适量，配成对照品溶液，精密量取一定量加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定含量。,注意：采用手工方式进样，建议使用内标法定量采用自动进样，可用内标法或外标法采用顶空进样，用标准加入法定量，可消除基质效应的影响,例：HPLC外标法测定阿司匹林泡腾片含量。测定方法：取本品（规格：0.1g）10片，精密称定为1.5760g,研细，精密称取0.0412g(约相当于阿司匹林25mg)，置100mL具塞锥形瓶中，精密加乙腈甲醇甲酸（40:59:1）溶液50mL，强力振摇10min使阿司匹林溶解，迅速滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密量取10L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿司匹林对照品适量，精密称定，加乙腈甲醇甲酸（40:59:1）溶液溶解制成1mL中含有0.52mg的溶液，作为对照品溶液，同法测定。测得供试品溶液峰面积Ax为154756（三次测定均值），对照品溶液峰面积Ar为155076（三次测定均值），按外标法以峰面积计算本品含量。问本品是否符合中国药典规定的含量限度（中国药典规定，本品含阿司匹林C9H8O4应为标示量的90.0%110.0%),第三节药品质量标准分析方法验证,目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中用途：药品质量标准起草时，分析方法需经验证药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证,需验证的分析项目1.鉴别试验2.杂质定量或限度检查3.原料或制剂中有效成分含量测定4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法,药品质量标准分析方法验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,一、准确度定义：表示分析结果与真实值接近的程度。准确度一般以百分回收率表示。1.含量测定方法的准确度（1）原料药的含量测定,（2）制剂的含量测定,2、杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定3、数据要求在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价例如制备3个不同浓度的样品，各测定3次,要求：（1）加入的对照品浓度应为高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，（2）UV和HPLC法：98%-102%（3）容量分析法：99.7%-100.3%,二、精密度精密度是指在规定的条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得结果之间的接近程度。（一）精密度的表示方法可用偏差、标准偏差或相对标准偏差(变异系数)表示,1.偏差测量值与平均值的差称为偏差，用D表示。偏差越大，精密度越低。,根据分析所用的方法不同，允许的相对偏差不同,2.标准偏差标准偏差是偏差平方的统计平均值，又称为均方根偏差。当测定次数n为有限次时，标准偏差（s）,3.相对标准偏差（RSD）,*容量分析法：0.2%（n=5）*UV法：1%（n=35）*HPLC法：2%（n=35）,变异系数,通常用百分数表示,（二）重复性、中间精密度和重现性1.重复性在规定的范围内，至少用9次测定结果进行评价（三个不同浓度的样品，各测定3次）2.中间精密度3.重现性4.准确度和精密度的关系,例：4个人对同一个样品进行测定，每人测6次,（三）专属性指在其他组分（如杂质、降解产