（吴伟诗、李思嘉）科技创新课题论文

2005科技创新课题脱硫细菌的分离纯化及其生物制剂制备吴伟诗，李思嘉（02生技3班）1 前言1.1 环境中硫的污染 硫对环境的影响主要表现为：大气中的SO2、H2S、废水中的硫酸盐与硫化物等所带来的污染。电力、石油炼制、有色金属冶炼、硫酸制备、化纤生产及炼焦、轻工、食品发酵，制药工业等的迅速发展，带来了大量的气态硫污染物或富含硫酸盐，硫化物的废水。硫污染的主要危害有：严重影响生态环境，危害人体健康；对金属，建筑材料和艺术品的强烈腐蚀作用；在废水好氧处理过程中，硫化物或硫酸盐过高，会促使丝状硫细菌大量繁殖，引起污泥膨胀；在厌氧生物处理过程中，硫酸盐通过对产甲烷菌初级抑制和次级抑制，严重影响废水厌氧处理的效率，甚至使厌氧发酵完全失败，传统物理化学脱硫法，由于能耗高，处理费用昂贵，污泥处置困难，促使人们寻找低能耗，高效率，经济而先进的处理方法，生物脱硫则为这一领域的研究及应用，展示了新的方向1。1.2 微生物脱硫技术微生物脱硫，又称生物催化剂脱硫（BOD，Biocatalytic Desulfurization），其目的是利用自然界存在的微生物脱除硫。通过微生物菌群的作用使S2-氧化成S单质2。 与物化法相比，生物脱硫具有许多优点：不需催化剂和氧化剂（除空气外）、不需处理化学污泥、产生很少生物污泥、低能耗、回收有价值的硫、没有或很少有硫酸盐或硫代硫酸盐排放、过程快、去除效率高，无臭味。微生物脱硫的缺点是：光合细菌脱硫，控制光照强度是关键；而无色硫细菌脱硫，控制反应体系的溶解氧浓度是关键；对过高浓度，极低浓度的硫化物去除效果不好，硫化物浓度过低，将被氧化成硫酸盐；硫化物浓度过高，对光合细菌或无色硫细菌有抑制作用；光合细菌脱硫则需要专门制作的光合反应器3。 从目前国内外微生物脱硫技术的发展状况看，该技术仍处于初始研究阶段，工业化程度不高。究其原因主要有两点，一是受微生物基础研究的限制。因微生物的生长和代谢与污染物数量、种类，生物种群的构成及环境因素有关，单纯的功能菌的工业放大有技术上的困难。生化过程的控制也影响到功能菌的培养与应用。现有资料显示，这方面的专向研究较少，使工业化过程缺少理论的依据与指导。二是微生物脱硫工艺与设备的研究比较滞后，效率高、经济实用技术与设备较少报道。而微生物脱硫技术的发展则主要集中在以下两个方面4：（1）高效功能菌的选育。随着基因技术的发展，该领域的研究将成为微生物脱硫技术发展的基础。（2）微生物对硫代谢途径的控制研究。如何使微生物代谢硫的产物更易从反应相中分离，或将代谢物固定在相中将是决定微生物脱硫技术能否得到市场认可的关键。1.3 生物制剂微生物制剂是以直接从自然界中分离的有益菌为主体开发出来的新型产品，主要来源土壤、粪便、机体肠道及水体，属于一种天然产品，无残留、无副作用，对于健康养殖具有极其重要的意义。微生物制剂在使用过程中应注意以下问题5:1.菌种变异由于细菌在人工培养条件下，经过多次移种后菌种不纯、退化，甚至菌种的生化特性也会发生不同程度的变化，影响使用效果。现在很多生产企业都没有很好保存菌种和在生产中控制细菌变异的条件和技术，所以生产的微生物产品达不到好的质量保证。2.活菌含量微生物制剂用于养殖水体起主要作用的是活性微生物，而活菌贮存受温度、氧环境、光照、湿度、酸碱度、挤压，存贮时间等因素影响，在贮存过程中活菌浓度会逐渐下降，在养殖中应用就达不到预期效果。微生物制剂的益生作用和通过有益微生物在养殖动物体内及水中施加有益菌的数量密切相关，数量不够，在体内及水中不能形成菌群优势，就不能发挥最大的益生作用。但目前除少数微生态制剂以液体形式上市外，绝大多数均通过发酵、收集菌体、干燥和固化处理后以固体形式投放市场，因此保证制剂中活性微生物的含量对发挥其益生作用至关重要，对其产品的检验也应采用活菌记数。国内目前对微生态制剂中活性微生物的含量尚无特别严格规定，也没有统一标准及检测方法、检测单位，而生产单位则任意提高活菌浓度说明。1.4 固定化细胞技术 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。20世纪70年代后,固定化微生物技术才直接从固定化酶技术发展而来。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,并使其保持活性及反复利用的方法。研究和应用表明,固定化微生物技术有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点6。目前,固定化微生物技术广泛应用于环境污染治理方面的研究,主要的治理对象为难处理的有机废水及重金属污染的废水,同时研究还涉及到大气和土壤的污染治理。1.固定化的方法和载体的选择固定化微生物的制备方法大致可以分为共价结合法、交联法、吸附法和包埋法7与新近发展的无载体固定化方法8,这些方法各有优缺点。共价结合法是利用微生物细胞表面功能团与固相载体表面基团之间形成化学共价键相连来固定细胞,因此结合紧密,稳定性好,但是基团结合时反应激烈、操作复杂，难控制。交联法是使微生物细胞与带2个以上多功能团的非水溶性交联剂进行交联,稳定性好,但反应激烈,会使细胞活性降低。吸附法是靠多空载体本身的吸附作用或静电引力将微生物细胞吸附固定。优点是反应温和、对细胞活性影响较小、操作简单、载体可重复利用,是传统的固定微生物的方法;缺点是抗冲击负荷相对较低,所固定的细胞数量受载体种类及其表面积的限制。包埋法是将微生物细胞包埋在半透性多聚物膜或凝胶小格中,具有操作简单、能保持微生物细胞的多酶体系、对微生物活性影响较小的特点,在废水处理中得到广泛的研究,是固定化微生物最常用的方法。无载体固定化方法是利用某些微生物具有自絮凝形成颗粒的特性,使微生物产生自固定,成为无载体固定化技术。这种固定化方法是一种全新的概念9:在自絮凝颗粒形成过程中,同时形成了微生物的适宜生态环境,使之有利于微生物代谢之间的协调。这种方法相比于以往的一些固定方法具有显著的优势,将在环境工程中的污水处理领域得到广泛的应用。10固定化载体通常包括两大类:无机载体,如多孔玻璃、硅藻土、活性炭，石英砂等;有机载体,如琼脂、聚乙烯醇凝胶(PVA)、角叉菜胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺(ACAM)凝胶等。无机载体常用于吸附法,高质量无机载体的指标之一是有较大的表面积。无机载体常与包埋载体结合,以提高包埋载体的强度,扩大孔径,提高包埋微生物的使用效率与寿命。吸附法中微生物与载体结合不牢固,易脱落,吸附数量不多;交联法固定微生物活性较低,很少单独使用。不同的固定化方法对固定化载体有不同的要求,理想的固定化载体应具备以下条件:对细胞无毒;传质性能好;性质稳定、不易被生物降解;机械强度高、使用寿命长;价格低廉。本次实验出于对实际应用中成本和效益的考虑，采用了吸附法制备脱硫细菌产品，并选择了二氧化硅粉作为吸附载体。2 材料与实验方法21 材料材料：泥样分别采自顺德塘泥 顺德河泥以及广州河泥。从泥样右分离纯化所得的脱硫细菌WWS0511，用于进一步生物制剂的制备。培养基及试剂：硫化钠标准液200mg硫离子/LNa2S.9H2O 1.5克 蒸馏水定容到1升培养基：选择性富集液体培养基：Na2S2O3.5H2O 5克 K2HPO4 2克 KNO3 2克 NaHCO3 1克 NH4Cl 0.5克 MgSO4.7H2O 0.6克 FeSO4.7H2O 0.01克 无菌水 1升pH7.0 琼脂平板培养基： Na2S2O3.5H2O 5克 NH4Cl 0.5克 KNO3 2克 NaHCO3 2克 自来水 1升 琼脂 40克pH7.0富集菌液培养基：Na2S2O3.5H2O 5克 K2HPO4 2克 KNO3 2克 NaHCO3 1克 NH4Cl 0.5克 MgCl2 0.6克 Na2S.9H2O 0.0375克 无菌水 1升 酵母浸膏 微量 蔗糖 2克 pH7.3 脱硫测试液： Na2S.9H2O 0.0375克（5mg硫离子/L） 0.075克（10mg硫离子/L） 0.15克（20mg硫离子/L） K2HPO4 2克 KNO3 2克 NaHCO3 1克 MgCl2 0.6克 NH4Cl 0.5克 蔗糖 2克 无菌蒸馏水 1升 （由于硫化钠不耐热，要分开过滤灭菌后添加）不同碳源对WWS0511菌株发酵的影响，待测碳源：葡萄糖 蔗糖 糖蜜盐酸溶液（6N）：浓盐酸（37） 591.9克 蒸馏水定容到1升 或 118.38克 蒸馏水定容到200毫升碘标准液（0.025N）：用适量蒸馏水溶解KI25克，再加上I2 3.2克，等碘充分溶解，定容到1000毫升。用0.025N Na2S2O3标定，用淀粉溶液作指示剂标准硫代硫酸钠溶液（0.025N）：Na2S2O3 6.025克 蒸馏水定容到1升淀粉指示剂溶液（最好即配即用）：实验用淀粉 2克 蒸馏水加热溶解定容到100毫升2.2 仪器设备手提式压力蒸汽消毒器 YX-280型 净化工作台（SW CJ2FO）752紫外光分光光度计 1013型不锈钢数显电热鼓风干燥箱DL5低速大容量离心机 LRH250微电脑控制生化培养箱 DELTA320pH计 23 实验方法2.3.1 菌液培养 提前两天将要用于接种的斜面放到培养箱活化，分别接种到含1的葡萄糖，蔗糖，糖蜜原始培养基（各两个对照）。于生化培养箱30光照条件pH7下培养，于650nm波长OD值，以此测生长曲线。待OD值到一定值稳定时进行下一步。2.3.2发酵培养基的制备（三种碳源：葡萄糖 蔗糖 糖蜜） 配制含0.2，0.5，1的葡萄糖，蔗糖，糖蜜的原始培养基（各两个重复）。加200ml到已消毒的250ml三角瓶，接入10菌液于生化培养箱30光照条件下培养。测OD值。2.3.3菌液培养 由2.3.2生长曲线所得的最佳碳源是蔗糖，所以将斜面菌种接种到含1蔗糖培养基（两个对照）。于生化培养箱30光照条件下培养，于650nm测OD作生长曲线。待OD值到一定值稳定时进行下一步。2.3.4发酵培养基的制备（三个温度：28 30 35） 由2.3.2生长曲线所得的最佳碳源是蔗糖，最佳浓度是0.2，所以配制含0.2的蔗糖原始培养基（每个温度两个重复）。倾200ml入消毒的250ml三角瓶，接入10菌液于生化培养箱光照条件分别为28、 30和35下培养。于650nm测OD并绘制生长曲线 。2.3.5菌液培养 由2.3.4生长曲线所得的最佳生长温度是30，所以将斜面菌种接种到含1蔗糖培养基（两个对照）。于生化培养箱30光照条件下培养，于OD650下测生长曲线。待OD值到一定值稳定时进行下一步。2.3.6发酵培养基的制备（三个pH值：pH5 pH6 pH7） 由2.3.4生长曲线所得的最佳生长温度是30，所以配制含0.2的蔗糖原始培养基（每个pH值两个重复）。倾200ml入消毒的250ml三角瓶，接入10菌液于生化培养箱光照条件30下培养。于OD650下每天测生长曲线。2.3.7生物制剂 根据以上步骤可以得出脱硫细菌最佳的发酵条件（碳源：0.2蔗糖 温度：30 pH值:pH7），利用以上条件进行脱硫细菌的大量发酵。菌液培养 将斜面菌种接种到含1蔗糖培养基（两个对照）。于生化培养箱30光照条件pH7下培养，于OD650下测生长曲线。待OD值到一定值稳定时进行下一步。发酵培养基的制备 配制含0.2的蔗糖原始培养基1500ml分别分装到6个250ml三角瓶，接入10菌液于生化培养箱30光照条件pH7下培养。待到细菌生长到对数期。发酵液的浓缩 将生长到对数期的1500ml发酵液放入经酒精灭菌的离心管进行离心浓缩。最后得到200ml的浓缩发酵液。细胞固定化 将200ml的发酵液与等量的经高温干热灭菌的二氧化硅粉混合，放入烘箱在45下进行烘干12小时。最后粉末装入1L瓶子里，成品完成。2.3.8成品菌落计数 称取1克成品配成菌液，用十倍稀释法倒平板，待平板长出菌落时计数。2.3.9成品脱硫能力的测定脱硫培养基的配制 配制含0.2蔗糖原始培养基（四个重复）。倾200ml入消毒的250ml三角瓶，取 1克成品于培养基，于生化培养箱30光照条件下培养。从培养的第一天起，连续四天测成品的脱硫能力。碘量法测定成品的脱硫能力先取10ml脱硫培养液加入250ml三角瓶，加入20ml碘标准液（0.025）后，再加入2ml的6N盐酸溶液，摇匀放入暗处静止5分钟，用标准硫代硫酸钠溶液（0.025）滴定至淡黄色后加5ml淀粉指示剂。滴至黄色消失，记录标准硫代硫酸钠溶液使用量。再用同体积蒸馏水代替脱硫培养液作空白滴定。计算： 硫化物（mg/L）=(V0V1)C16000/V式中：V0为空白滴定所用标准硫代硫酸钠溶液体积 V1为脱硫培养液滴定所用标准硫代硫酸钠溶液体积 C为标准硫代硫酸钠溶液浓度，一般为0.025N V所取测定硫化钠溶液的体积，一般为10ml脱硫能力的测定每隔14天测一次成品的脱硫能力共测3次3 结果与分析3.1发酵条件的确定3.1.1碳源的确定表1 不同浓度葡萄糖培养液在OD650下连续6天的OD值 1天 2天 3天 4天 5天 6天 0. 2 0.1585 0.171 0.319 0.3925 0.3505 0.341505 0.1725 0.207 0.345 0.426 0.366 0.3871 0.1775 0.1775 0.2825 0.3655 0.3195 0.391表2 不同浓度蔗糖培养液在OD650下连续6天的OD值 1天 2天 3天 4天 5天 6天0 2 0.5255 0.53 0.517 0.6125 0.695 0.69250 5 0.566 0.469 0.466 0.452 0.57 0.57351 0.5545 0.5045 0.5135 0.5675 0.593 0.58表3 不同浓度糖蜜培养液在OD650下连续6天的OD值 1天 2天 3天 4天 5天 6天0 2 0.2375 0.376 0.463 0.535 0.5 0.53350 5% 0.3915 0.5755 0.7435 0.919 0.968 1.1551% 0.5475 0.7985 1.021 1.2535 1.346 1.6885由实验数据得出以上表1 表2 表3和图1 图2 图3，由图可以看出脱硫细菌在不同碳源，不同浓度的条件下生长曲线，很明显地看出图3中糖蜜为碳源的培养液生长曲线最好，吸光度最大值接近1.8，因为在测量过程中并未对超出范围的培养液进行稀释，不能排除那是因为糖蜜颜色太深而造成测量有误差，而且糖蜜含有较多的灰质及其他杂质，可能对细菌生长造成影响。从图1图2比较发现蔗糖培养液中脱硫细菌生长曲线最好，菌数最多，在发酵过程的第一天菌数开始大量增加，原因是因为细菌原来培养基中养分消耗掉，原有培养基中养分不足已提供给细菌生长，将菌液接种到新培养基中，养分充足，所以细菌得到很好的生长，而且由图所得0.2蔗糖培养液对细菌得生长是最有利得，菌数最多，所以可以确定0.2蔗糖为碳源的为最佳碳源。3.1.2温度的确定表4 不同温度下0.2蔗糖培养液在OD650下连续6天的OD值 1天 2天 3天 4天 5天 6天28 0.185 0.2595 0.4185 0.5485 0.646 0.61830 0.201 0.2655 0.499 0.6535 0.743 0.69935 0.1875 0.2425 0.3865 0.4285 0.5495 0.5245由图4可以看出30时菌液的吸光度最大，菌数最多，从而得知该脱硫细菌的最佳生长温度为30，35时菌数最小，所以不是很适合脱硫细菌的生长。3.1.3pH的确定表5不同pH值下0.2蔗糖培养液在OD650下连续6天的OD值 1天 2天 3天 4天 5天 6天pH5 0.2115 0.303 0.3595 0.412 0.496 0.513pH6 0.242 0.3175 0.3895 0.44 0.5165 0.525pH7 0.3105 0.478 0.5805 0.6845 0.801 0.795由图所得，pH7时吸光度最大，菌数最多，从而得知该脱硫细菌的最佳生长pH值为pH7。我们还可以明显地看到pH5和pH6时菌数上升缓慢，说明pH值对该脱硫细菌的生长有比较明显的影响。32菌落计数表6 菌落计数 104 105 106 107第一次计数 273 184 43 15第二次计数 219 139 40 1433脱硫能力的测定硫化物（mg/L）=(V0V1)C16000/V式中：V0为空白滴定所用标准硫代硫酸钠溶液体积 V1为脱硫培养液滴定所用标准硫代硫酸钠溶液体积 C为标准硫代硫酸钠溶液浓度，一般为0.025N V所取测定硫化钠溶液的体积，一般为10ml表7 2月222月25滴定硫化物所需硫代硫酸钠的量（单位：ml） 1天 2天 3天 4天重复1 7.1 9.3 11.2 14.9重复2 7.0 9.5 11.5 15.2重复3 6.9 9.2 11.1 15.3重复4 7.3 9.6 11.7 15.1对照 11.9 12.8 13.6 16.9根据式可以求出硫化物含量，得表8 4天里硫化物含量变化（单位：mg/L） 1天 2天 3天 4天重复1 192 140 96 80重复2 196 132 84 68重复3 200 144 100 64重复4 184 128 76 72表8 3月73月10滴定硫化物所需硫代硫酸钠的量（单位：ml） 1天 2天 3天 4天重复1 10.3 11.3 13.0 14.0重复2 10.2 11.2 12.9 13.7重复3 10.4 10.9 12.7 13.9重复4 10.5 11.2 12.6 14.2对照 15.2 15.2 16.4 16.7根据式可以求出硫化物含量，得表9 4天里硫化物含量变化（单位：mg/L） 1天 2天 3天 4天重复1 196 156 136 108重复2 200 160 140 120重复3 192 172 148 112重复4 188 160 152 100表10 3月253月28滴定硫化物所需硫代硫酸钠的量（单位：ml） 1天 2天 3天 4天重复1 11.2 12.1 12.9 13.7重复2 11.5 12.2 12.7 13.9重复3 11.3 12.4 13.0 13.5重复4 11.2 12.0 12.7 13.7对照 16.1 16.5 16.8 17.1根据式可以求出硫化物含量，得 表11 4天里硫化物含量变化（单位：mg/L） 1天 2天 3天 4天重复1 196 172 156 136重复2 184 176 164 128重复3 192 164 152 144重复4 196 180 164 136从三次脱硫能力测定可以看到培养液中硫化物的含量逐天减少，说明该菌是具有脱硫能力的，第二次脱硫能力测定时的硫化物含量每天减少的量明显比第一次测定时少，而第三次也是比第二次少，说明该成品脱硫能力会随着时间的推移脱硫能力有所降低，到一定时间后，该成品的脱硫能力会降低为零，利用这个现象就可以测定成品使用的有效期限。4结论与讨论41该株脱硫细菌发酵的最佳条件碳源的浓度对该脱硫细菌的影响。因为碳源过于丰富，容易引起菌体异常增值，对菌体的代谢有明显的抑制。反之，碳源不足，仅仅供给维持量的碳源，菌体生长和产物合成都会停止11。由实验所得控制碳源的浓度为0.2，是最适合该脱硫细菌的生长的。温度对该脱硫细菌的影响。由于微生物生长是一系列酶促反应的结果，因此从酶动力学角度来看，酶促反应导致温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很容易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响菌体的产量。所谓发酵的最适温度，是指在该温度下最适于微生物的生长。最适温度是一种相对的概念，它是在一定的条件下测得的结果。不同的的微生物和不同的培养条件以及不同的生长阶段，最是温度也应有所不同。由于温度对微生物的生长，繁殖有重要的影响，因此为了使微生物的生长速度最快数量最多，在发酵过程中必须根据微生物菌种的特性，选择和控制最适温度12。由实验所得最适温度为30。pH对该脱硫细菌的影响。pH过高或过低能抑制微生物体内某些