（温伟盛）科技创新项目结题报告书

项目类别项目批准号 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：植物提取物配伍发酵对枯草芽孢杆菌溶纤活性的影响 申 请 人：吴恩法 温伟盛 廖宏所在院部：食品学院 专业年级：2003级生物工程 联系电话指导教师: 方祥 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 六日 结题日期： 二 六 年 四 月 六 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称植物提取物配伍发酵对枯草芽孢杆菌溶纤活性的影响项目类别A、文科类； B、理科类；(理科类)申请经费1500元起止年月2005.52006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字温伟盛男1984.103生物工程(1)班食品学院3.15单因素发酵试验温伟盛吴恩法男1985.103生物工程(1)班食品学院3.4多因素发酵试验吴恩法廖宏男1984.1003生物工程(2)班食品学院3.5产物食品化加工廖宏指导教师情况姓名方祥性别男学位硕士职称副教授研究方向食品生物技术授课名称微生物学项目简介纳豆芽孢杆菌能够分泌一种具有纤溶作用的碱性丝氨酸蛋白激酶。纳豆激酶的溶栓和抗栓效果很好，无毒副作用，是目前被公认的一种较好的溶栓治疗作用中草药。本实验是通过从中草药、水果、蔬菜中的提取液出与纳豆杆菌共发酵并测定出其酶的活性，从中筛选出最高酶活的材料，为进一步研究提供科学基础。二、项目研究的内容与方法1、培养基营养琼脂培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl0.5%,琼脂2%，121、20min灭菌。种子培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl0.6%,葡萄糖0.5%；121、20min灭菌。豆乳的制备：将大豆洗净，除去杂质，用蒸馏水浸泡12小时后，放进打桨机（每次500ml蒸馏水、50g干大豆），打豆桨后过滤两遍，105、5min灭菌。基础培养基：可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，121、15min灭菌。发酵培养基（豆乳培养基）：豆乳10mL+基础培养基10mL+蒸馏水20mL（分别灭菌后在无菌条件下加入并混合）2试剂0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH7.8）纤维蛋白原溶液：用上述缓冲溶液配成，浓度0.4%凝血酶溶液：用上述缓冲配制而成，浓度为10U/mL琼脂粉溶液：用上述缓冲溶液配成，浓度为3%尿激酶溶液：用上述缓冲溶液配制而成不同浓度3方法与工艺流程 工艺流程： 菌种活化扩大培养接种植物汁液提取稀释 巴氏灭菌黄豆清洗精选浸泡打浆过滤豆乳灭菌基础培养基 测NK活性 摇瓶发酵保藏冻干方法：（1）纳豆枯草芽孢杆菌的保存与活化：纳豆枯草芽孢杆菌斜面菌种置于4冰箱里保存，并且每23个月转种保藏一次。菌株使用前先用营养琼脂培养基活化培养24小时。（2）扩大培养：无菌条件把10ml提取液加入至装有40ml（250mL三角瓶）发酵培养基的三角瓶中，并接种入种子培养液（2.5mL）。放于37，200rpm摇瓶培养72小时。（3）纳豆激酶活性测定：纤维蛋白平板法：将纤维蛋白原溶液、琼脂溶液、凝血酶溶液按一定比例倒入无菌平皿中，小心振荡摇匀，室温凝固制成平板。在平板上打孔后，加上梯度浓度的尿激酶，37孵育18小时后，测定溶透明圈的大小，作出尿激酶标准曲线。根据被检样品溶有透明圈大小计算出被检样品相当于尿激酶的活力单位。（4）标准曲线的制作方法：将10mL3%的琼脂粉溶液置于微波炉中溶化至透明后，自然冷却到50左右，同时在50水浴中加热纤维蛋白原溶液10mL,待纤维蛋白原溶液呈现乳白色，与冷却至50琼脂粉溶液混合，摇匀，快速加入0.5mL凝血酶溶液，迅速混匀倒入平皿（f=9cm）。凝固后打孔（6孔/皿）。取尿激酶（1万单位/瓶）倍比稀释至5000、2500、1250、625、321.5U后，分别20L流入纤维蛋白平板的小孔内，于37温育18小时后，倒适量10%三氯乙酸溶液于平皿中，作用30分钟终止反应。用游标卡尺测量透明圈相互垂直的两个直径和孔的直径，分别计算两者面积。以透明圈和小孔面积之差（S-s）的对数值为横坐标，尿激酶酶活单位（U）的对数数值为纵坐标作图，即得尿激酶标准曲线和酶活计算公式。（6）纳豆激酶活性的测定：采用上述方法制作好纤维蛋白平板后，将发酵液加入孔中（20L/孔，每瓶发酵液分别在三个皿上各滴一孔），于37保温18小时后取出，倒适量10%三氯乙酸溶液于平皿中，作用30分钟终止反应。用游标卡尺测量透明圈相互垂直的两个直径。将计算出的透明圈面积代入由标准曲线所得的酶活计算公式，即可得到纳豆激酶活性值。4、研究内容（1）第一轮：中草药中的发酵试验所选用的中草药（市售）：姜黄、绞胶蓝、白果、山楂、银杏叶、桃仁、益母草、黄精、五味子各十克。提取液的制备：每种中草药取10克，放入水100ml，温火褒半小时，然后把所得的药液过滤，后把滤液过滤，再把滤液按梯度稀释原溶液10倍，100倍，加上本身的原溶液，各取出10ml放入试管中，即得到三支都为某种中草药的10ml的原溶液、1：10的稀释液、1：100的稀释液。用塞子塞好，75水浴30秒。 把已灭菌的基础培养基（10ml）、豆乳（10ml）加上所得的提取液10ml都倒入一个装有蒸馏水（10ml）已灭菌的三角瓶中（以上操作都是在无菌操作台中进行）。然后用移液管（已灭菌）吸取2.5ml的种子培养液进入三角瓶中，之后用牛皮纸包好，放在37，200r/m的摇床中发酵72小时。三天后取样点孔，测得其纳豆激酶的活性大小（包括一个空白对照的）。（2）第二轮：所选用的水果：葡萄、苹果、梨、提取液的制备：每种水果称取一定量，加入相等质量的蒸馏水放入到打桨机内打桨，再把所得液过滤。然后按梯度稀释原溶液的10倍、100倍，加上本身的原溶液，各取出10ml放入试管中，即得到三支都为某种水果的10ml的原溶液、1：100的稀释液、1：100的稀释液。用塞子塞好，灭菌温度同上中草药的处理。按与中草药一样的处理去发酵。三天后测定其酶活（同样包括一个空白对照）（3）第三轮：选用的蔬菜：香蕉、洋葱、番茄、胡萝卜、白萝卜、橙提取液的制备及处理与水果相同。（4）第四轮：所选用的材料：大白菜、芹菜、西瓜、蒜头提取液的制备及处理同水果。（5）第五轮：再次做中草药的复试验选用的中草药：姜黄、白果、绞胶蓝、银杏叶、益母草、黄精、五味子、操作步骤同以前的。（6）第六轮：再测水果选用的材料：苹果、梨、草莓、操作步骤同之前的。5、结果与分析（1）尿激酶的标准曲线图1：尿激酶标准曲线（2）中草药提取液对MBS04-6的产酶活力的影响如表1可见，不同的中草药浸提液对MBS04-6的产酶活力有较大的影响，同一种中草药其浸提液浓度不同，对发酵液的纤溶性酶活性也有较大影响，五味子的100倍稀释液、绞股蓝原液及10倍稀释液对共发酵液MBS04-6的产酶活力具有正向促进作用，其中绞股蓝10倍稀释液效果最好，发酵液酶活达2143.0 U.mL-1，是对照的4.6倍；而白果、山楂、黄精和益母草对MBS04-6产纤溶酶活性具有明显的抑制作用，有的还完全抑制酶的表达。可能与这些中草药中的某些生物活性物质抑制菌体的生长繁殖，从而影响纳豆芽包杆菌的产酶能力有关。表1：中草药浸提液对MBS04-6产纤溶酶活性的影响（单位：U.mL-1） 样品稀释倍数五味子银杏叶姜黄绞股蓝白果山楂黄精益母草空白1060.5401145.780.90201.229.69463.881087.19361.60434.82143.0063.500463.881001013.3473.890317.2500069.62463.88 图2：不同稀释倍数的绞股蓝浸提液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响由图3可见，稀释1倍和倍的绞股蓝浸提液能提高产酶活力，尤以稀释10倍的绞股蓝浸提液的影响效果较为明显，其发酵液酶活力达到空白对照的4.6倍。但稀释00倍的绞股蓝浸提液反而降低纤溶酶活力，可能是因为绞股蓝浸提液浓度降低，其本身的纤溶能力下降，从而使得发酵液整体的纤溶能力降低。（3）果蔬汁提取液对MBS04-6的产酶活力的影响 D3E3B3A3F3图3：几种果蔬汁共发酵液纤溶酶活性（左图：A-香蕉、B-洋葱、D-胡萝卜、E-白萝卜、F-桔子，右图：A-苹果、B-雪梨、C-草莓、O-空白；1、2、3分别表示稀释度为1：1、1：10和1：100；）由表2可知，果蔬汁原液中白萝卜汁和橙汁能对发酵液酶活正向促进作用最强，其酶活分别是对照的2.1倍和1.5倍； 果蔬汁10倍稀释液中，对MBSO4-6 产酶活力起正向促进作用的只有白萝卜和洋葱，而番茄、香蕉、胡萝卜和橙的汁液对纤溶酶活觉有不同程度的抑制作用，其中番茄对产纤溶酶活性的抑制作用最为明显，其发酵液酶活只有空白对照的0.58%；稀释100倍的果蔬汁液中，香蕉汁和橙汁对纤溶酶活性具有正向促进作用，胡萝卜汁具有明显的抑制作用，其余果蔬汁对产纤溶酶活性的影响不太明显。表2： 不同稀释度的不同果蔬汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响 u/mL样品稀释倍数香蕉洋葱 番茄胡萝卜白萝卜橙空白11873.304846.54372.811581.78216.95518.31/10124.89613.332.2909.59680.54665.85518.31/1007398.96023.73143.0675.65225.97537.45518.3 图4：不同稀释倍数的白萝卜汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响（U.mL-1）由图4可见：白萝卜汁液稀释10倍对产酶活力的影响较为明显，达到空白对照的2.1倍。表3：水果汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响（U.mL-1）样品稀释倍数苹果雪梨草莓空白图5：水果汁液对MBS04-6产纤溶酶活（三个稀释度汁液共发酵液酶活之和）的影响由表3可见，在高浓度下，苹果和草莓对产纤酶活力有正面影响，在三种浓度下加雪梨汁液的效果都不明显，反而有抑制作用。从总的影响来看，只有加苹果汁液的发酵液酶活大于空白对照的三倍，所以得出苹果是较理想的目的样品。由图6所示，苹果、雪梨、和草莓按的比例混合的原汁液对的产纤溶酶活的影响较大，而且发酵液的酶活达到大于只加苹果原液时发酵液的酶活（4250u/mL）。在考虑到发酵液风味的情况下，这种混合汁液也是不错的选择。图6：苹果、雪梨、草莓混合汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响6结果与讨论经过比较和筛选，我们得出稀释10倍的绞股蓝浸提液和白萝卜汁液，苹果汁原液，苹果、雪梨、和草莓按的比例混合的原汁液对的产纤溶酶活具有较好的正向促进作用，其共发酵液酶活分别是空白对照酶活的4.6倍、2.1倍、1.66倍和1.8倍。其中以绞股蓝的正面作用最为突出。微生物由于自身存在丰富的酶系而有着在温和条件下分解转化物质的能力。通过微生物与中草药共发酵来进行中药炮制可以比一般的物理化学手段更大幅度地改变药性和，提高药效，降低毒副作用，扩大适应。而果蔬十人们日常生活中不可缺少的食品，它可能含有一种人体内纤溶酶原激活剂，将纤溶酶原激活为纤溶酶，继而起到溶解血栓的作用。这样具有直接溶纤能力的纤溶酶和间接纤溶能力的中草药浸提液和果蔬汁液如果共同作用于人体内的血栓，可以起到双管齐下的良好效果。因此，如果把绞股蓝或果蔬按一定的比例来与纳豆杆菌共发酵可以明显地促进产酶活力。这也是我们本次试验的一个突破点，为进一步的研究铺路。三、项目研究过程与资料查阅情况1资料查阅通过对中国期刊网、优秀硕博士论文数据库、维普全文数据库查阅了大量的文献资料，并将有关部分资料并整理后得知，到2007年世界老龄人口（大于60岁）数目将达62900万，而在中国老龄人口数目将达13400万，超过全国人口总数的10%，在我国，愈八成老年人患有心血管疾病，心脏血管疾病已成为中国人的首位死因，每年死于此类疾病施手术风险大，费用高治标不治本。而传统的中医主要服用中草药，促进血液循环溶解血栓，但用量较大，而且效果不太明显。例如常用的心脑康胶囊，四天的用量就要发费49.5元，对国人而言是一个不小的经济负担。近年来，日本发现纳豆菌分泌的纳豆激酶可有效抑制血小板凝固,有助于预防高血压和动脉硬化。目前，有关纳豆激酶的研究方兴未艾，各国争先以此为突破口研制治疗心脑血管疾病的新药。我们的研究课题是通过现代生物工程技术，利用中草药等植物提取物与纳豆菌共发酵，提高发酵液中纳豆激酶的活性或提高纳豆激酶的产量，加上中草药本身的药物作用，提高药物治疗心脑血管的效果。2研究过程第一轮：时间从2005年8月18日至10月5日； 内容：对中草药的发酵试验第二轮：时间从2005年10月9日至10月15日；内容：对水果的发酵试验第三轮：时间从2005年10月17日至10月23日；内容：对香蕉、洋葱、番茄、胡萝卜、白萝卜、橙的发酵试验第四轮：时间从2005年10月24日至10月30日：内容：大白菜、芹菜、西瓜、蒜头第五轮：时间从2005年11月1日至11月8日；内容：再次做中草药的复试验第六轮：时间从2006年3月8日至3月14日：内容：对苹果、雪梨、草莓的试验四、项目成果完成形式和价值1、经过比较和筛选，几种中草药中稀释10倍的绞股蓝浸提液可促进枯草芽孢杆菌的产酶活性，其酶活为对照的4.6倍；几种果蔬汁中白萝卜汁液和苹果汁原液，明显促进酶活的产生