核酸类药物

第十二章核酸类药物,主要核酸类药物的生产,2,概述,1,12.1概述,核酸类药物的生产方法,2,核苷酸的生物合成及其代谢调节,3,基本概念,1,12.1.1基本概念,12.1.1基本概念,12.1.2核酸类药物的生产方法,酶解法半合成法直接发酵法,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,1.嘌呤核苷酸的生物合成途径（1）嘌呤核苷酸的生物合成途径见P184图12-2嘌呤核苷酸的生物合成途径及有关的酶（2）嘌呤、核苷酸生物合成系的突变,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,2.嘧啶核苷酸的生物合成途径,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,3.核苷酸合成的补救途径,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,4.嘌呤核苷酸生物合成的代谢控制（1）肌苷酸生物合成的代谢控制,12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节,（2）嘌呤核苷酸互变的代谢控制,12.2主要核酸类药物的生产,三磷酸腺苷的制备,2,核苷类药物的制备,3,RNA与DNA的提取与制备,1,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,1.RNA及其工业来源（1）高产RNA菌株的筛选,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,（2）影响RNA产量的因素,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,（3）RNA提取（以酵母提取RNA为例）,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,2.DNA的提取与制备（1）工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100，保温15min，迅速冷却至2025，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95%乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含50%60%热变性DNA。,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,（2）具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1min，匀浆于2500r/min离心30min，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3min；加入2倍量5%的十二烷基磺酸钠（用45%乙醇作溶剂），并搅拌23h，在0，2500r/min离心，在上层液中加入等体积的冷95%乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。,12.2.1RNA与DNA的提取与制备,粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5%的十二烷基磺酸钠（用45%乙醇作溶剂）达1/10体积，搅拌1h，经5000r/min离心1h，清液中加入NaCl达1mol/L，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA。活性DNA制备需在03下操作完成。,12.2.2三磷酸腺苷的制备,1.以嘌呤为前体生产ATP的工艺流程及控制要点,12.2.2三磷酸腺苷的制备,（1）发酵生产腺苷生产菌种直接发酵生产腺苷的菌种应为具备Xan-+Gu-+dea-+8AGr+Np-遗传标记的枯草杆菌菌株。培养基培养基的碳源以葡萄糖为佳，若添加少量核糖，可增加腺苷的产量。,12.2.2三磷酸腺苷的制备,（2）微生物磷酸化生产AMP和ATP,12.2.2三磷酸腺苷的制备,2.直接发酵生产ATP的工艺及控制要点（1）菌种采用产氨短杆菌ATCC6872菌株进行发酵。（2）种子培养以葡萄糖3%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、NaCl0.25%为种子培养基，于30振荡培养24h，即得种子培养液。,12.2.2三磷酸腺苷的制备,（3）发酵培养基葡萄糖10%、KH2PO41.0%、K2HPO41.0%、MgSO47H2O1.0%、ZnSO47H2O0.001%、CaCl22H2O0.01%、FeSO47H2O0.001%、胱氨酸0.002%、-丙氨酸0.0015%、生物素30g/L、硫胺素盐酸盐0.5mg/L、尿素0.2%.（4）发酵培养在5L培养罐中，装入3L培养基灭菌后，接种上述种子培养液300mL，培养时用氨水调pH=68，于32通气搅拌培养。培养1天后添加腺嘌呤3g/L及适当的表面活性剂，再培养2天后，ATP发酵产量可达8g/L。,12.2.3核苷类药物的制备,1.肌苷发酵生产(1)生产菌种,12.2.3核苷类药物的制备,（2）肌苷产生菌的选育,12.2.3核苷类药物的制备,（3）肌苷发酵工艺及控制要点碳源大多使用葡萄糖常用的氮源有氯化铵、硫酸铵或尿素等磷酸盐对肌苷生成有很大影响肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株，因此培养基中必须加入适量的腺嘌呤或含有腺嘌呤的物质氨基酸有促进肌苷积累，同时节约腺嘌呤用量的作用培养基以外的发酵条件，如pH值、温度、通气搅拌等也都是影响肌苷积累的重要条件,12.2.3核苷类药物的制备,2.聚肌胞苷酸（聚肌胞）（poyinosinic，polycytidylicacid，pIC）的生产20世纪70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺流程如下：底物预处理酶促反应分离等物质的量polyI和polyC混合,12.2.3核苷类药物的制备,（1）底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备流程,12.2.3核苷类药物的制备,（2）固定化多核苷酸磷酸化酶的制备酶的制备固相载体的制备固定化多核苷酸磷酸化酶,12.2.3核苷类药物的制备,（3）polyIC制备底物预处理。CDP吡啶盐转化成锂盐，IDP转化成钠盐酶促反应。每毫升反应液含以下物质的浓度（mol/L）为：I