“挑战杯”决赛论文——金鱼草

活性氧在金鱼草切花向重力性反应中的作用研究作者姓名：刘华明 范 玉 李韵琦 陈会星 李 茂指导老师姓名：张昭其华南农业大学园艺学院，广州，510642摘 要向重力性反应是导致金鱼草等切花商品价值降低、包装运输成本高的重要原因之一。而植物的向重力性反应是一个复杂的生理生化过程，因此，研究金鱼草向重力性问题无论在理论上还是在实践上都具有重要意义。有研究表明，活性氧是细胞信号转导和调控组成成分，并且还参与了生长素介导的细胞伸长过程。与此同时，许多研究也表明Ca2+参与了植物向重力性反应的各个环节。本文从这个角度出发，综合考虑这两种重要因素对金鱼草向重力性反应的影响，采用能激发植物内源H2O2产生的水杨酸（SA）、过氧化氢酶（CAT）的抑制剂氨基三唑（AT）、NADPH氧化酶抑制剂Imadizole（Im）及一氧化氮释放剂硝普钠（SNP）处理采后金鱼草切花，研究这些药剂处理对抑制金鱼草向重力性反应中的效果及生理作用，并从生理和分子水平讨论4种主要的抗氧化酶CAT、APX、NADPH氧化酶、HATP酶与活性氧信号及金鱼草向重力性的关系，从分子水平探讨钙信号相关基因CDPK、CAM 与向重力性反应的关系。关键词：活性氧 抑制剂 诱导剂 金鱼草 向重力性AbstractThe Regulating Root Gravitropism has bad effects on cut flower, Antirrhinum majus for instancelower value and high cost of packaging and transportation. Its a complex physiological and biochemical process. So its significant to study the Gravitropism in theory and practice. Some studies showed that Reactive oxygen controlled to some degree the regulation in the Gravitropism of root. Whats more, it is component of cellular signal transduction and controlling,involved in auxin-mediated cell elongation. Research also shows that the Ca2 + are involved in the Gravitropism of root of the various links. From this perspective, we use medicaments of SA,CAT,AT,IM,SNP that can stimulate plants to produce H2O2 to handle Post-harvest Antirrhinum majus, research the effects and physiological function of medicaments processing on Regulating Root Gravitropism and discuss the connection between enzyme of CAT,APX,NADPH, HATP and signal of Reactive oxygen species and the Gravitropism at the physiological and molecular level and the relation of the Ca signal gene of CDPK、CAM and the Gravitropism at molecular level.Key words：Reactive Oxygen;Inhibitor; Inducer;Antirrhinum majus;Gravitropism16目 录1 前言42 材料与方法42.1 材料及处理42.1.1药剂浓度筛选42.2方法与步骤42.2.1 经药剂处理后切花形态特征的观察42.2.2生理指标的测定52.2.3 APX活性的测定52.2.4 H2O2含量的测定52.2.5 O-活性的测定52.2.6 NADPH活性的测定62.2.7 CAT活性的测定62.3基因的克隆及其表达62.3.1金鱼草总RNA的提取62.3.2 cDNA第一链的合成62.3.3相关基因cDNA片段的扩增和检测62.3.4相关基因的cDNA 3末端克隆62.3.5 Northern杂交方法72.4 数据处理73 结果与分析73.1 药剂处理后的金鱼草切花向重力性的表现73.2活性氧相关基因的克隆与序列测定93.3 酶活性的变化和活性氧相关基因的表达模式103.3.1 SA、SNP药剂处理与H2O2含量的变化103.3.2 SA处理对CDPK和CAT基因表达情况103.3.3 SNP处理对CDPK和CAT基因表达情况114 讨论13参考文献141 前言金鱼草（Antirrhinum majus L.）为玄参科秋播一年生草本，近年来培育出多种多倍体品种及优良的杂种一代，不仅花大而密、色彩艳丽、茎杆粗壮高大，而且耐寒性、抗病性都有所提高，花期又长，是园林中最常见的草本花卉。国际上广泛用于盆栽、花坛、窗台、栽植槽和室内景观布置，近年来常做线性花材用于插花观赏。金鱼草切花不耐挤压，但采切过早花蕾又不易开放，因此必须在花序基部有2朵-3朵花开放、上部花蕾初初绽时采切为宜。然而，金鱼草切花在水平装箱运输过程中，常发生花茎向上弯曲的现象，导致商品价值降低（高俊平，20031）。此现象称为“向重力性反应”。该类切花包装时需要垂直放置于专门设计的包装箱中，大大增加了鲜切花的包装运输成本。因此，我们需要找出抑制其向重力性反应的方法，通过测试经过处理后的氧化酶活性的变化及活性氧含量等生理指标，从而得出其反应的机理。2 材料与方法2.1 材料及处理从岭南花卉市场中国芊卉集团广州切花部购买前一晚采收次日凌晨空运到广州的有46朵小花开放的金鱼草切花，运回实验室，修剪切花基部，保持每支切花约50cm长，垂直插于盛有400ml蒸馏水的2L的量筒中过夜，所有切花即呈直立状态。第二天将垂直处理后的金鱼草切花取出，再把切花修剪成25cm长，插于盛有各种处理液（参照后面实验材料药剂处理方法）的1L的塑料量筒内，垂直或水平放置于实验台上（即给予重力性刺激）。金鱼草切花具有特定的向重力性反应部位，该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理后的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。2.1.1药剂浓度筛选利用AT（氨基三唑）浓度筛选设置的浓度有1、10、15、20、30、40、50（mmol/L）、MJ（茉莉酸甲酯）（mmol/L）、（这个药剂的没有浓度筛选吧？ ）SA（水杨酸）浓度筛选设置的浓度有0.01、0.1、0.5、1（mmol/L）、 Imidazole（NADPH）抑制剂浓度筛选设置的浓度有1、10、15、20、30、40、50（mmol/L）和SNP（硝普纳）浓度筛选设置的浓度有0.05、0.07、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5（umol/L）等进行处理，对于各个药剂都通过设置浓度梯度筛选出最优的浓度。2.2方法与步骤2.2.1 经药剂处理后切花形态特征的观察将切花放入已设计好的浓度梯度药剂中处理，将鲜切花剪至50cm，置于装有500ml的对照和处理液的量筒中，垂直放置，处理24h后将花取出，再将其剪至35cm，放于水平放置的装有400ml的蒸馏水塑料瓶中，保持金鱼草鲜切花水平放置。观察得出不同药剂在处理后0、0.5、1、2、4、8h的金鱼草先端的弯曲程度，以及处理后金鱼草花蕾有无特殊变化，从中得出最有效的弯曲抑制剂浓度分别为：1mmol/L SA、0.2mmol/LSNP、15mmol/L AT以及50mmol/LIm。2.2.2生理指标的测定得出有效的药剂浓度后，我们将选择该浓度下进行切花处理，并切取该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。测定的指标包括H2O2含量、O-2含量、OH-含量、APX，CAT、NADPH氧化酶活性、Ca2-ATPase活性、NADPH 氧化酶等。2.2.3 APX活性的测定提取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加5 ml酶提取液(50 mM PBS,pH 7.0, 2mM AsA, 5mM EDTA，现配现用)，12000 rpm 于4下离心20min，得上清酶液5 ml左右，置冰浴中待用。先在比色皿中加入100ul的酶液，再加入2.75ml反应液（含50 mMPBS,pH7. 0, 0. 1 mMEDTA，0.3 mmol/L AsA），最后加入150ul0.1% H2O2启动反应，在290nm处测定OD290值变化，以OD290每分钟减少0.001表示一个酶活力单位（U）,酶的活性以Ug-1FW表示，重复3次。2.2.4 H2O2含量的测定参照周碧燕（2006）的方法并有所改动。取金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮1g，加入5ml 5% 4三氯乙酸（TCA）和0.2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以及少量活性碳，液氮或冰浴研磨，12000 rpm 于4下离心20min，上清液调pH值至8.4（25%氨水（200ul左右）2M乙酸），（过滤并用少量的5%TCA洗脱吸附在滤纸上的残余的溶液，）并用pH 8.4的TCA定容至6ml。取1ml上清液，30水浴30min，加入1ml显色液于500nm处比色，以1ml上清液中加入10ug过氧化氢酶作为空白，记录OD值，重复2次。从标准曲线上查OD值所对应H2O2数值，然后计算H2O2含量。2.2.5 O-活性的测定取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)，在 10000rpm 4离心 15分钟。取上清液 1ml加入磷酸缓冲液 0.9ml和 10mM盐酸羟胺0.1ml，在 25混合并培养20分钟。取 1ml培养液依次加入 1ml 17mM对氨基苯磺酸和1ml 7mM a萘胺，在 25反应 20分钟，10000rpm离心5分钟后分层 ,取正丁醇相测A530。用磷酸缓冲液代替样品作空白。2.2.6 NADPH活性的测定按Sagi和Fluhr（2001）的方法进行，采用提取纯化的细胞膜囊，通过NADPH氧化酶产生的活性氧氧化XTT的量来表示该酶活性。反应体系1ml包括50mm Tris-HCl 缓冲液(pH7.4) 0.5mm XTT,100m NADPH和15-20 g 蛋白量的细胞膜微膜囊，加入NADPH启动反应，XTT 减少量可通过470 nm检测。本底值（background production）可在反应系统中加入50 units SOD 测得。酶活性可通过XTT比吸收系数2.16104 m 1cm 1换算成活性氧的量来表示。2.2.7 CAT活性的测定参照戴宏芬（1991）的方法，酶液的提取同POD，3ml反应液中包括：1ml 0.2% H2O2(以0.05molL-1的磷酸缓冲液配制),1.95ml双蒸水和50ul粗酶液，在240nm处测定OD240值变化，以OD240每分钟减少0.001表示一个酶活力单位（U）,酶的活性以Ug1FW表示，重复3次，测4分钟。2.3基因的克隆及其表达2.3.1金鱼草总RNA的提取本实验采用Wan和Wilkins（1994）的热硼法从金鱼草茎段表皮提取总RNA2.3.2 cDNA第一链的合成以金鱼草果皮总RNA为模板，采用TaKaRa cDNA合成试剂盒反转录合成第一链cDNA，反转录酶为Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（TaKaRa），引物为Oligo（dT）18和Random 9 mers（TaKaRa）。2.3.3相关基因cDNA片段的扩增和检测以上述合成的cDNA为模板，采用TaKaRa PCR Amplification kit进行PCR扩增，具体方法按照说明书进行。PCR反应条件：94预变性3 min ，共计35个循环（94变性1 min、 Tm退火1 min、72延伸2 min）的反应，72延伸10 min，-30 保存备用。PCR反应结束后，用1%琼脂粉凝胶电泳检测扩增反应是否正常进行或扩增的片段大小是否正确。2.3.4相关基因的cDNA 3末端克隆cDNA 3 端的扩增采用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）方法。所用试剂为TaKaRa 3-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒。试剂盒原理：进行 3 RACE 实验时，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）将Poly(A)+ RNA反转录成cDNA，然后再使用TaKaRa LA Taq（TaKaRa Code：DRR02），以反转录的cDNA为模板，进行套式PCR反应。3 RACE Adaptor Primer作为反转录引物用于cDNA合成。RACE引物见表1.2。PCR反应结束后，用1%琼脂粉凝胶电泳检测反应是否如期进行及扩增的片段大小是否正确。目的基因片段回收、连接、转化、鉴定及测序同上。2.3.5 Northern杂交方法将结合有总RNA的尼龙膜放入装有5% SDS、50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)和50%去离子甲酰胺溶液的杂交袋中，赶尽气泡后封口，放入杂交箱中，于80下润洗尼龙膜1 h，重复一次。用适量的2SSC溶液洗去甲酰胺，将尼龙膜放入杂交袋，加入预杂交液，赶尽气泡后封口，放入45的杂交箱中进行预杂交 3 h。预杂交液包含以下成分：50 %去离子甲酰胺、5SSC、7%SDS，2 %阻断剂、50 mM pH7.0磷酸钠和0.1 % N-lauroylsarcosine sodium salt (w/v)。预杂交完成后，倒出预杂交液，将已变性好的DIG标记的探针加入相同的缓冲液中，于杂交箱中过夜杂交，杂交温度为45 。杂交完后将膜取出置于装有2SSC（含0.1 % SDS）的塑料饭盒中，在脱色摇床上漂洗两次，每次10 min。再用0.1SSC（含0.1 % SDS）在63 下洗膜两次，每次30 min，经过抗原抗体结合后的膜用Tween-20洗去未结合的抗体，然后用CDP-StarTM通过化学发光原理检测杂交信号的强弱。2.4 数据处理数据分析用DPS统计软件进行分析。3 结果与分析3.1 药剂处理后的金鱼草切花向重力性的表现通过观察不同试剂不同浓度处理金鱼草向重力性影响效果，我们筛选得到了最佳的活性氧诱导剂和抑制剂的浓度。图1 经SA处理后4小时后金鱼草茎段弯曲情况对照通过观察我们可以发现，经SA处理4h后，金鱼草切花的弯曲度明显较CK（没有药剂处理的金鱼草切花）低，并且随着SA浓度的增加，金鱼草切花的弯曲情况受到的抑制效果越明显，1mmol/L的效果最好。更重要的是再经过药剂SA处理后，金鱼草的花苞能正常开发，花瓣颜色无受损表现。图2 经SNP处理4小时后金鱼草茎段弯曲情况对照通过SNP处理4h后的金鱼草茎段弯曲度对比，我们发现经0.2m和0.5m的SNP处理效果都十分明显，但在处理后我们发现0.5m的浓度对金鱼草的花苞有伤害作用，花瓣边缘出现褐变，花苞开放受抑制。而0.2m浓度处理下的花苞无该现象出现，所以我们认为0.2m的SNP效果更优。图3 经AT处理4小时后金鱼草茎段弯曲情况对照同样，通过AT处理4h后的金鱼草茎段弯曲度对比，我们发现15m的AT对金鱼草弯曲的抑制效果最明显，并且对花苞没有表现出损害现象。图4 经Im处理4小时后金鱼草茎段弯曲情况对照对比CK与药剂Im处理4h后的金鱼草茎段弯曲度，我们发现随着Im浓度的上升，其对金鱼草弯曲的抑制效果就越明显，但高于50m时则会出现对切花花苞损伤的情况，所以50m是最佳的处理浓度，并测试在该浓度处理下的金鱼草切花的各项生理指标。3.2活性氧相关基因的克隆与序列测定1) 获得了与活性氧相关的基因（CAT、APX、NADPH氧化酶）的片段序列和3端序列：所获得的CAT基因片段序列长度为512bp，在NCBI上进行BLAST，结果显示该cDNA片段与已发表的编号为gb|AAX88799.1| catalase Euphorbia characias序列相似性达93%。APX基因片段序列长度为249bp，与已发表的编号为gb|AAX84654.1| ascorbate peroxidase Lycopersicon esculent 序列相似性达90%。NADPH氧化酶基因片段序列长度为473bp，与已发表的编号为emb|CAC84140.1| NADPH oxidase Nicotiana tabacum序列相似性达77%，是目的片段。3端序列长度分别为：CAT1012bp，APX 653bp，NADPH氧化酶720bp。2) 获得了与活性氧相关的基因（CDPK、CAM）的片段序列和3端序列：所获得的CDPK基因片段序列长度为347bp，与已发表的编号为emb|CAC83000.1| calcium-dependent protein kinase 2 Nicotiana benthamiana序列相似性达94%。CAM基因片段序列长度为371bp，与已发表的编号为gb|ABR21756.1| calmodulin Actinidia polygama序列相似性达98%。3端序列长度分别为：CDPK948bp，CAM559bp。3.3 酶活性的变化和活性氧相关基因的表达模式3.3.1 SA、SNP药剂处理与H2O2含量的变化SA、SNP药剂处理对H2O2含量影响表明：与对照比较，SA处理金鱼草水平放置后2h内，上下侧H2O2基本上比对照高，可见，SA处理诱导了金鱼草H2O2的产生。水平放置0.5h内，SA处理和对照的金鱼草下侧H2O2含量比上侧高；水平放置0.5h之后，SA处理的金鱼草上侧H2O2含量始终比下侧高，而对照是水平放置1至4h，金鱼草上侧H2O2含量才比下侧高，而6h时，上下侧基本一致。SA处理的金鱼草上下侧H2O2含量在2h和4h达到低峰值，并非常接近。可见，金鱼草经SA处理后，上侧H2O2含量在0.5h后就比下侧高，缓减了上下侧H2O2的浓度剃度，从而抑制向重力性反应。与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置4h内，上下侧H2O2含量都比对照高，可见，SNP处理诱导了金鱼草H2O2的产生。SNP处理金鱼草在水平放置过程中，除了6h下，上下两侧H2O2含量接近外，其他时间点都是上侧比下侧高，而对照是在前2h，下侧含量比上侧高，而24h内基本接近，6h时，上侧比下侧高。可见，SNP处理缓减了上下侧H2O2的浓度剃度，从而抑制向重力性反应。3.3.2 SA处理对CDPK和CAT基因表达情况由图1和图2可知，与对照比较，SA处理金鱼草在水平放置2h内，上下侧CDPK表达都比未放置时表达强； 4h内，CDPK基因是上侧比下侧表达强，而对照是2h内，下侧比上侧表达强，46h内才是上侧比下侧表达强，而且随着时间水平放置时间的延长，表达逐渐减弱。而可见，SA处理诱导了金鱼草CDPK的表达，尤其是诱导了上侧CDPK基因表达。CK0 SA0 CK0.5(上) CK0.5(下) SA0.5(上) SA0.5(下) CK1(上) CK1(下) SA1(上) SA 1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SA0 SA2(上) SA2(下) CK4(上) CK4(下) SA4(上) SA4(下) CK6(上) CK6(下) SA6(上) SA6(下) 图1 SA处理金鱼草CDPK基因表达的变化图2 SA处理金鱼草CDPK基因表达的量化变化由图3可知，与对照比较，SA处理金鱼草在水平放置时上下侧CAT表达逐渐增强，达到最强，而且2h时上侧表达比下侧的强，而后随着处理时间延长而逐渐减弱；而对照是1h内，CAT基因表达较强，而且是下侧比上侧表达强。可见，SA处理诱导了金鱼草CAT的表达，尤其是诱导了上侧CAT基因表达。CK0 SA0 CK0.5(上) CK0.5(下) SA0.5(上) SA0.5(下) CK1(上) CK1(下) SA1(上) SA 1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SA0 SA2(上) SA2(下) CK4(上) CK4(下) SA4(上) SA4(下) CK6(上) CK6(下) SA6(上) SA6(下) 图3 SA处理金鱼草CAT基因表达的变化3.3.3 SNP处理对CDPK和CAT基因表达情况由图4和图5可知，与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置时上下侧CDPK表达达到最强，而且2h时下侧表达比上侧的强，而后随着处理时间延长而逐渐减弱；而对照是0.5h内，CDPK基因表达较强，也是下侧比上侧表达强，而后随着处理时间延长表达逐渐减弱。可见，SNP处理延缓了金鱼草CDPK的表达。CK0 SNP0 CK0.5(上) CK0.5(下) SNP0.5(上) SNP0.5(下) CK1(上) CK1(下) SNP1(上) SNP1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SNP0 SNP2(上) SNP2(下) CK4(上) CK4(下) SNP4(上)SNP4(下) CK6(上) CK6(下) SNP6(上) SNP6(下) 图4 SNP处理金鱼草CDPK基因表达的变化图5 SNP处理金鱼草CDPK基因表达的量化变化由图6和图7可知，与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置时上下侧CAT表达都比对照强；在2h内，CAT基因表达逐渐增强达到最强，此时，上侧比下侧表达强，而后随着处理时间延长表达逐渐减弱。对照是0.5h表达最强，而后逐渐减弱。可见，SNP处理延缓了金鱼草CAT的表达，抑制了金鱼草的向重力性反应。CK0 SNP0 CK0.5(上) CK0.5(下) SNP0.5(上) SNP0.5(下) CK1(上) CK1(下) SNP1(上) SNP1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SNP0 SNP2(上) SNP2(下) CK4(上) CK4(下) SNP4(上)SNP4(下) CK6(上) CK6(下) SNP6(上) SNP6(下) 图6 SNP处理金鱼草CAT基因表达的变化 图7 SNP处理金鱼草CAT基因表达的量化变化4 讨论本文利用活性氧的抑制剂或诱导剂处理金鱼草切花后，观察其表现得出水杨酸（SA）、氨基三唑（AT）、Imadizole（Im）和硝普钠（SNP）等很好的抑制了金鱼草切花的向重力性反应。通过对处理后的切花进行取样，测得其茎段上下表皮的活性氧含量，表明SA和SNP药剂处理对H2O2含量产生了影响，而H2O2的含量变化与金鱼草向重力性的表达呈正相关。这表明了活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）作为植物细胞内的信号分子参与了植物的向重力性反应。与Joo等（2001）报道的重力信号可诱导玉米根下侧活性氧浓度提高，采用抗氧化剂（N-acetylcysteine, Ascorbic acid, and Trolox）处理以消除活性氧的浓度梯度，则可抑制根的向重力性反应；Friedman等（2003）采用水杨酸处理金鱼草等几种切花，发现水杨酸可以有效的抑制切花的向重力性反应（Friedman et al., 2003）所发现的情况一致，这充分证明了水杨酸处理后，诱导了金鱼草积累活性氧，从而消除了花茎上下侧的活性氧梯度。此外，活性氧信号与钙信号密切相关，细胞质内Ca2+浓度（钙信号）取决于细胞膜上的Ca2通道活性或开放程度、质膜Ca2+泵、质膜Ca2+运转系统的激活程度等，活性氧对上述调节因素都表现一定的调控作用Pei等（2000）。我们通过对SA和SNP处理后的金鱼草切花进行活性氧基因的提取与测定，发现经过药剂处理后的金鱼草，其水平放置后上下侧CDPK基因和CAT基因的表达都受到了明显的影响。其中SA处理诱导了金鱼草CDPK基因和CAT基因的表达，尤其是诱导了上侧CDPK基和CAT基因的表达。而SNP处理延缓了金鱼草CDPK基和CAT基因的表达。这表明了SA处理可诱导活性氧含量提高，而活性氧可大大激活离体细胞的钙通道活性，将活性氧信号与钙信号联系起来，表明活性氧信号与钙信号协同参与了植物的信号转导。抑制剂SNP处理, 使活性氧的积累受到抑制, 同时抑制了细胞伸长区的生长。达到抑制向重力性反应的作用。本实验通过人为地调节果实内源活性氧浓度及钙浓度的变化（即活性氧信号和钙信号变化），成功的抑制了金鱼草切花的向重力性反应，并且成功的将提取了活性氧基因，并且从分子水平探讨钙信号相关基因CDPK、CAM 与向重力性反应的关系。我们希望该成果能够帮助人们理解鲜切花采后的向重力性反应规律，有助于人们