基因重组工程.ppt

第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineering),基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。,重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用,第一节重要的工具酶,工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。,一、限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性，一般分为三类：、和型，其中常用的是型限制酶。,限制酶（型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5粘性末端3粘性末端平端或钝端回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出或3末端突出的碱基序列相互具有互补性。,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,产生平(头末)端/钝端,其它特殊性质的型限制酶,同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。,同裂酶同识同切,同裂酶同识异切,同尾酶,同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。,可变酶,可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，Bstp，其识别顺序为GGTNACC。,常用限制性核酸内切酶的特性,二、DNA聚合酶,（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶DNA聚合酶大片段Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶,DNA聚合酶,E.ColiDNA聚合酶（DNApol）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：53DNA聚合酶活性53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性,DNApol应用,催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；第二条cDNA链的合成；对DNA3突出末端进行标记；DNA序列分析。,E.coliDNApol.催化切口平移,Klenow片段（DNApol.大片断）,Klenow片段用途,补齐双链DNA的3末端；用标记碱基补齐3末端；,在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；DNA序列分析。,TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）,作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075，2）95以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,第一课件网在线网站,三、逆转录酶,特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,逆转录酶的应用：将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；补平和标记5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析；制备杂交探针等。,四、DNA连接酶(DNAligase),DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5-ACGAATTCGT-3T4DNA连接酶5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAAGCA-53-TGCTTAAGCA-5（2）修补带有缺口的双链DNA分子,五、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32,在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,重要的工具酶,第二节基因克隆常用的载体,载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。,本节主要内容载体必须具备的基本条件载体的种类常用的载体,一、载体必须具备的基本条件,有自身的复制子，能独立复制具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段。表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。,二、载体的种类*,（一）克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：能够在受体细胞复制；带有药物抗性基因，便于筛选；可导入受体细胞。（二）表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件转录和翻译所必须的DNA顺序。,三、常用的载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选3.具有多克隆位点,总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等,pBR322质粒,4363bp含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)一个抗四环素标记(tetR)ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外原基因插入抗药基因位点时，AmpRAmp敏感(AmpS)、TetRTet敏感(TetS).,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶,(二)噬菌体,组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,噬菌体两种生长途径（示意图）,第三节重组DNA基本原理,（DNA重组基本程序包括下列过程）分获取目的基因和载体接目的基因与载体的连接转重组DNA导入宿主细胞筛重组DNA的筛选与鉴定,1、获取,DNA重组基本过程,2、重组,3、转化,4、筛选,5、克隆,6、表达,表达产物分离纯化,一、目的基因的获取（分）,目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。目的基因来源1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应4）人工合成基因,（一）制备基因组DNA（基因文库）分离、纯化基因组DNA条件：温和，在EDTA或SDS等存在下RE用蛋白酶K消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离分别与同样RE消化的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体DNA连接酶连接。导入细胞进入宿主细胞内培养扩增。筛选鉴定用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。,（二）制备cDNA（cDNA文库）,（1）合成cDNA第一条链反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。引物是与mRNA3端polyA互补的寡聚dT（1218dT片段）（2）合成cDNA第二条链RNase去掉模板mRNA（3）构建cDNA文库cDNA两端加接头或衔接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。cDNA与载体相连。导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。,（二）制备cDNA（cDNA文库）,分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA,导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库,（三）聚合酶链反应(PCR),在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94变性、54退火及72延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。（四）人工合成基因引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。,二、目的基因与载体的连接（接）（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法,（一）粘性末端连接将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。,（三）人工接头法合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA。,（四）同源多聚尾连接法,三、重组DNA导入宿主细胞（转）,无性繁殖体外重组后的DNA导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞.,重组DNA导入宿主细胞的类型转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,四、重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）1）平板筛选2）限制酶切图谱筛选3）PCR筛选重组体4）原位杂交技术,插入失活蓝白筛选,（一）平板筛选是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。,第一课件网在线网站,抗生素平板筛选（插入失活）,（2）蓝-白筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。,载体：编码-半乳糖宿主：编码-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列,-互补,细菌表达：-半乳糖苷酶活性蛋白,5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal）形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG存在下）,蓝白筛选示意图,2.限制性内切酶图谱鉴,3.PCR筛选重组体抽提少量重组DNAPCR扩增电泳鉴定序列分析。,4.原位杂交技术,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件基因的编码区不能被插入序列所中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,第四节重组技术在医学和制药工业中的应用,一、疾病基因的发现1990年美国科学家首先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如，已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可