Hela细胞转染实验报告.pdf

Hela 细胞的传代培养及生长周期观察 HE 染色观察 高学敏 生 36 2013012322 一、实验背景 （一）关于 Hela 细胞 Hela 细胞是源自美国妇女 Henrietta Lacks 的子宫颈癌细胞，取于 1951 年， 属于增殖型表皮癌细胞。在体外培养条件下，经过筛选，目前实验使用的 Hela 细胞为无限细胞系，在适宜条件下可以无限分裂，不会衰退，可以连续传代。 经过六十多年，Hela 细胞已经被培养出多个细胞系，它几乎成为细胞生物学中 的一种“模式生物” 。似癌细胞的特征，其核型已非二倍体型，而是非整数倍体 （aneuploid） 。2013 年 Andrew Adey 等人在 Nature 发表的研究表明，Hela 细胞 的基因组相当稳定，可将不同细胞系区分开的点突变和基因拷贝数改变相当少 1，这是 Hela 细胞的一大特点。 （二）原代培养、传代培养、衰退 进行细胞体外培养前，最初需要从活体中获得细胞。从体内获得细胞进行 的首次培养为原代培养。当原代培养细胞增殖达到一定密度后，需要做继代培 养，被称为传代培养。 细胞在体外培养过程中的群体生存状况与在完整机体内的生存与衰老死亡 基本一致；本次所做的 Hela 细胞实验为 Hela 细胞传代实验，即将已长到相当 密度的原培养皿中的 Hela 细胞转移至新培养皿中培养。 在原代培养期，细胞增殖能力弱，第一次传代后，部分细胞可以重新贴 壁，此时细胞增殖能力增强；另外亦是为了获得更多的细胞，因此进行传代操 作。 培养的组织细胞在体外可以反复传代十几次左右，若传代十几次后细胞进 入衰退阶段并死亡，则该细胞系称为有限细胞系；若在衰退阶段，部分细胞的 遗传特性发生改变，可以无限传代，则该部分细胞将发展为无限细胞系。Hela 细胞系即为无限细胞系，已历经六十多年的传代培养。 （三）贴附型细胞与悬浮型细胞 在体外培养时，根据细胞能否贴附于支持物上分为贴附型细胞和悬浮型细 胞两类。大多数细胞系属于贴附型细胞，血液中的白细胞和某些癌细胞属于悬 浮型细胞。Hela 细胞属于贴附型细胞，它需要贴附于支持物上才可能存活并增 殖。 （四）两次传代之间的细胞周期 在两次传代之间，未更换培养基时，细胞经历一个生长周期。刚进行传代 后，细胞处于潜伏期。潜伏期中细胞适应新环境，贴附型细胞重新贴壁，因此 潜伏期又可细分为游离期与贴附期。 潜伏期结束后细胞进入指数生长期，指数生长期中已贴壁的细胞快速进行 有丝分裂，使得培养皿中细胞密度快速增加。有丝分裂前，Hela 细胞圆化，似 与周围贴壁的未进行分裂的细胞分离，在实验条件下，Hela 细胞的细胞周期约 为 24 小时。多数普通细胞存在接触抑制现象，即当平皿中的细胞相互接触，密 度达到 100%时细胞将停止分裂。但是许多癌细胞不存在接触抑制现象，Hela 细胞属于不存在接触抑制现象的细胞。指数生长期后，平皿中细胞密度可达 100%，甚至存在数层 Hela 细胞，此后细胞生长进入平台期。 平台期，Hela 细胞不继续进行增殖，群体共同生存一段时间。若不更换培 养基，细胞群体将进入衰退期。衰退期间，即将死亡或死亡细胞脱离上浮，仍 然贴壁的细胞内颗粒增加，细胞状态渐差，贴壁细胞密度开始逐渐降低。 本次实验中，在 Hela 细胞培养的近 1 周时间内，未曾更换培养基，由于代 谢废物在培养基中的积累、营养物质被消耗、细胞大量增殖等原因，培养皿中 的 Hela 细胞将经历完整的一个生长周期。 （五）细胞体外培养的培养基与培养条件、进行传代操作时使用的消化液 细胞在体外培养时，需要提供与体内近似的环境。这些环境因素包括：基 本营养物质、生长刺激因子、水、温度、pH 条件、无菌的环境、湿度、光照、 气体环境等。本次实验采用 90%DMEM 高糖培养基加上 10%胎牛血清与各 1% 的青霉素与链霉素组成混合细胞培养液。DMEM 培养基可供给细胞合适的营养 物质及 pH 条件等，胎牛血清可供给细胞某些仍然未知的生长因子，两种抗生 素可提供一定的抑制其他微生物生长的作用，但并不能保证一定不会有其他微 生物生长，因此进行操作时，注意无菌操作才是避免污染的核心。抗生素的作 用效果随时间逐渐衰退，且抗生素对于细胞有一定毒性。 将 Hela 细胞置于 37，5% CO2培养箱中培养。一方面由于 37为人体温 度，适宜于从人体中分离出的 Hela 细胞的生长；另一方面 5%的 CO2可以维持 培养液的 pH，且降低氧分压，由于过高的氧含量可能对细胞产生毒害作用（虽 然没有明确的实验在证实过高的氧含量对培养细胞可能产生毒害作用，但是我 猜测可能与病人在吸氧时不能吸纯氧是相似道理，氧气含量过高导致氧中毒。 这可能的原因是过高的氧气含量将胞内物质氧化，还生成大量自由基，对细胞 产生毒害。 ） 。培养箱中为黑暗环境，由于光照可能分解培养基中的物质，从而 产生可能对细胞有害的物质。 如体内的细胞，体外培养的细胞之间亦存在细胞外基质。细胞外基质的主 要成分为胶原纤维、弹性纤维等蛋白类物质及透明质酸等糖类物质。在进行传 代时，需要将细胞外基质消化，才能将细胞从贴附状态变为悬浮状态，且使得 细胞分散开来。消化采用 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液。体外培养的细 胞贴壁过程中，贴壁所需要的蛋白质需要有 Ca2+, Mg2+等离子才能发挥活性， 因此，在消化液中添加 EDTA 这一金属螯合剂，可以结合 Ca2+, Mg2+等离子， 帮助消化。胰蛋白酶的作用即为分解细胞外基质中的蛋白质，使得彼此粘连的 细胞分散开来。但胰蛋白酶发挥作用也需要 Ca2+, Mg2+等因子，因此，EDTA 加 入量需适宜，以保证胰蛋白酶能顺利发挥作用。在消化过程中，需要将平皿置 于 37培养箱中，以保证 Hela 细胞能维持活性，且胰蛋白酶能有一定活性。 尽管胰蛋白酶的最适 pH 为 8.0，但为了保持细胞活性，pH 值调节至 7.4。 血清中的物质可以抑制胰蛋白酶的活性，从而终止消化。因此，在进行消 化前，需要用 PBS 溶液洗涤细胞以除去血清的成分。终止消化时，可以加入含 血清的培养液。 （六）HE 染色 HE 染色，全称 hematoxylin-eosin staining，即苏木精-伊红染色法。该染色 方法主要使细胞核及粗面内质网（核糖体）呈现蓝紫色，而细胞质及细胞质外 基质呈现粉红色。 染色前首先需要进行固定操作。固定所用溶液为 Carnoy 固定液。固定液中 的醋酸可使细胞膨胀，而甲醇则使细胞皱缩，二者配合，可迅速杀死细胞并保 持其生前的状态。 苏木精为碱性染料，易溶于乙醇，微溶于水和甘油。苏木精需要呈现氧化 状态才能使用，且需要金属离子作为媒染剂，本实验中使用 KAl(SO4)224H2O 作为媒染剂。苏木精能与细胞内呈酸性的结构结合，主要为细胞核（染色质） 及粗面内质网（核糖体） 。苏木精在酸性条件下呈现红色，在碱性条件下呈现蓝 色。 伊红为酸性染料，能与细胞内呈碱性的结构结合，使其呈现红色。伊红分 为醇溶伊红 B 和水溶伊红 Y 两类。本实验中使用的伊红为醇溶伊红。伊红能使 细胞质及细胞外基质中的胶原纤维和弹性纤维等着红色。 进行 HE 染色时，用 0.5%盐酸酒精溶液进行分色，可使与细胞结合不紧密 或非特异性结合的苏木精被洗脱；用 0.5%淡氨水进行返蓝操作，为营造碱性环 境，从而使苏木精呈现蓝色。理论上，用苏木精和伊红进行的染色均为物理染 色，在长时间的水洗条件下，颜色都可以被洗去。固定之后的所有染色操作均 可以重复进行。 二、实验用品 1.1. 实验器材实验器材 超净工作台、倒置相差显微镜、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅、水浴锅、 离心机、显微拍照系统、滤膜、35mm 平皿、吸管架、计数板、计数器、酒精 灯 2.2. 实验材料实验材料 Hela 细胞 3.3. 试剂试剂 1）PBS 溶液 2）消化液：0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 溶液 3）细胞培养液: 配方如下表： （含酚红） 表.1 细胞培养液配方 试剂 含量 DMEM 培养基（高糖） 90% FBS 血清 10% 青霉素 100 U/mL 链霉素 100g/mL 用 7.4%NaHCO3溶液调节 pH 至 7.2。 4）Carnoy 固定剂 5）苏木精染液：称取苏木精染料 1 g，溶于 20 mL无水乙醇中；称取钾明 矾 50 g，溶于 300 mL蒸馏水中。待上述两种溶液完全溶解后混合，煮沸 3-5 分 钟后加入蒸馏水至 1000 mL，最后加入 0.2 g 碘酸钠，过滤备用。 6）0.5%盐酸酒精溶液（以 70%乙醇配制） 7）弱碱性溶液：0.5%淡氨水（以蒸馏水配制） 8）0.5%伊红染液：以 80%乙醇溶。 三、实验步骤 (一) Hela 细胞的传代 1）取待传代的 Hela 细胞（由助教准备） ，镜检。倾斜平皿，将旧的培养液吸 出。 2）用 1 ml PBS 洗细胞一次。 倾斜平皿，从平皿的一侧向平皿内加入 1 ml 枪 PBS 溶液。枪头口不可接 触平皿表面，加液时不可直接冲击细胞层。轻轻晃动平皿数次，再将清洗 液移除。 3）进行消化处理。 平置平皿，向平皿内的细胞表面滴加 200 l 消化液。置于 37，5% CO2 培养箱中处理 2 min 后，取出镜检。若观察到多数细胞已经圆化，则可以 终止消化。 4）终止消化 加入 500 l 细胞培养液（DMEM+）终止消化。反复吹吸冲洗细胞层。 待液体浑浊，皿底清亮后，则表示已基本冲干净。再反复吹吸，以便将细 胞团冲散，形成均匀的细胞悬液。吹吸时最好不产生气泡。 5）1000 rpm离心 5 分钟，去除上清液，加入 920 l 细胞培养液 （DMEM+）重悬细胞。留取 20 l 用于计数。 6）分盘培养 向原皿中加入 1200 l 细胞培养液（DMEM+） ，取 300 l 细胞悬液加入 原皿中，轻轻晃匀。向新皿中放入一张飞片，再加入 900 l 细胞培养液 （DMEM+） ，使平皿被浸润。取 600 l 细胞悬液加入新皿中，尽量减少晃 动。 原皿分盘后进行镜检。 7）培养 置于 37，5% CO2培养箱中培养。 8）计数 将 20l 细胞悬液带出细胞间，加入等体积的 PBS 溶液稀释，用血球计数 板进行计数。 置于二氧化碳培养箱中，37、5%CO2培养。 (二) Hela 细胞的生长周期观察 1）在 Hela 细胞生长的潜伏期观察一次细胞形态（编号 5，7） 2）在 Hela 细胞生长的对数期观察一次细胞形态及分裂（编号 5，7） 3）在 Hela 细胞生长的衰退期观察一次细胞形态（编号 5，7） (三) HE 染色及观察 1）培养细胞 40 小时后，从培养箱中取出原皿，镜检细胞的生长状况。从平 皿边缘加入 1 ml PBS 溶液，轻轻晃动漂洗后移除。重复一次。 2）以 10%Carnoy 固定液在室温下固定 15min。固定过程中随时镜检。 3）苏木精染液染色 从平皿一侧加入苏木精染液，加入量以完全覆盖平皿内细胞为准。染色过 程中以明视场随时镜检，当观察到细胞核着上蓝紫色后，再染 5min 左右。 总耗时 12min。 4）漂洗 向平皿中加满蒸馏水，吸去。再次加满后，倾斜平皿置于开着小水流的自 来水龙头下漂洗 10 min。漂洗后镜检。 5）分色 吸干平皿内的水。加入数滴 0.5%盐酸酒精溶液，加入后迅速补加入大量 蒸馏水，迅速吸去。再次用流动自来水冲洗 2min。漂洗后镜检。 6）返蓝 吸干平皿内的水。加入 0.5%淡氨水，覆盖细胞，轻晃数次，观察到平皿 内的颜色变蓝后加入蒸馏水，迅速吸去。以流动自来水冲洗 2 min。漂洗后 镜检。 7）伊红染色 吸干平皿中的水。滴加数滴伊红染液，轻晃 30 秒后加入蒸馏水，迅速吸 去。以蒸馏水漂洗 1 min。 8）观察 镜检观察染色情况。发现细胞核染色过浅，而胞质红色过深。故返回第 3 步重新操作。 9）重复操作的过程 苏木精染液染色时间延长至 15min，苏木精染色后漂洗时间缩短至 1min。不进行分色，直接进行返蓝，返蓝时间延长至 30 s。返蓝后将平皿 中的淡氨水漂洗干净。最后在平皿中加入 2 ml 蒸馏水，再滴加 1 滴伊红染 液（即将伊红染液稀释） ，此时染色时间可以延长，在镜下镜检，当胞质染 色足够红且不影响胞核的蓝色时，可以将伊红洗去。最终镜检发现结果良 好后可以不再重复染色。 四、实验结果 (一)Hela 细胞传代计数 表.1 Hela 细胞传代计数 视野序号 细胞数目（5 个中方格） 1ml 细胞悬液中细胞数目* 1 60 2 65 3 63 4 59 平均值 61.75 3.09106 （注：1. 计数的最大误差为 9.71% 2. *1ml 细胞悬液中细胞数目计算公式： 1ml 细胞悬液中细胞数目=5 个中方格中细胞数目5 25稀释倍数10 4 3. 本次计数未进行稀释。 ） (二)Hela 细胞生长周期观察 1. Hela 细胞潜伏期形态(2015 年 11 月 12 日 19 时观察) (1) 5#平皿 图.1 5#平皿 Hela 细胞潜伏期形态（40 倍物镜） 图 1 注：1 箭头所指细胞为贴壁的Hela 细胞。细胞形态变得不规则，不随晃动的液体而 运动；2 箭头所指的仍然处于漂浮状态的 Hela 细胞，细胞呈现圆球形。 (2) 7#平皿 图.2 7#平皿 Hela 细胞潜伏期形态（40 倍物镜） 图 2 注：1 箭头所指细胞为贴壁的Hela 细胞。细胞形态变得不规则，不随晃动的液体而 运动；2 箭头所指的仍然处于漂浮状态的 Hela 细胞，细胞呈现圆球形；3 箭头所指 为已经沉底的 Hela 细胞，因其所处平面与贴壁细胞相同，它们可能即将贴壁 2. Hela 细胞对数期形态（2015 年 11 月 14 日 9 时观察） (1) 5#平皿 1 2 1 2 3 图.3 5#平皿 Hela 细胞对数期形态（40 倍物镜） 图 3 注：1 箭头所指细胞为已经贴壁的Hela 细胞，许多贴壁细胞相互接触，形成细胞 岛；2 箭头所指为圆化的Hela 细胞，可能即将进行分裂。贴壁细胞状况良好，胞质 内颗粒细小且均匀。 图.4 5#平皿 Hela 细胞对数期细胞密度情况（10 倍物镜） 图 4 注：对数期 Hela 细胞大量贴壁，细胞密度已达 60%左右。贴壁细胞间有较多圆化 细胞准备进行分裂。 (2) 7#平皿 1 2 图.5 7#平皿 Hela 细胞对数期形态（40 倍物镜） 图 5 注：1 箭头所指细胞为已经贴壁的Hela 细胞，许多贴壁细胞相互接触，形成细胞 岛；2 箭头所指为圆化的Hela 细胞，可能即将进行分裂；3 箭头所指为正在进行有 丝分裂的 Hela 细胞，推测应处于细胞分裂的末期，胞质正在分裂；4 箭头所指为刚 完成分裂的 Hela 细胞，细胞形态较圆，个体较小。贴壁细胞状况良好，胞质内颗粒 细小且均匀。 图.6 7#平皿 Hela 细胞对数期细胞密度情况（10 倍物镜） 图 6 注：对数期 Hela 细胞大量贴壁，细胞密度已达 70%左右。贴壁细胞间有较多圆化细 1 2 3 4 胞准备进行分裂。 3. Hela 细胞衰退期（2015 年 11 月 17 日 19 时观察、2015 年 11 月 18 日 16 时观察） (1) 11 月 17 日 19 时观察 5# Hela 细胞 图.7 5#平皿 Hela 细胞进入衰退期时细胞形态（40 倍物镜） 图 7 注：1 箭头所指为仍然贴壁的细胞；2 箭头所指为死亡或即将死亡的细胞，不贴壁且 形态不规则。整张图中可见细胞密度基本达到 90%以上，基本不可见进行有丝分裂的细 胞，部分区域开始出现贴壁细胞脱落后的空洞。 (2) 11 月 17 日 19 时观察 7# Hela 细胞 1 2 1 2 图.8 7#平皿 Hela 细胞进入衰退期时细胞形态（40 倍物镜） 图 8 注：1 箭头所指为仍然贴壁的细胞；2 箭头所指为死亡或即将死亡的细胞，不贴壁且 形态不规则。整张图中可见细胞密度基本达到 90%以上，基本不可见进行有丝分裂的细 胞，部分区域开始出现贴壁细胞脱落后的空洞。 (3) 11 月 18 日 16 时观察 5# Hela 细胞 图.9 5#平皿 Hela 细胞衰退期间细胞形态（40 倍物镜） 图 9 注：1 箭头所指为仍然贴壁的细胞；2 箭头所指为已经死亡或即将死亡的细胞，已脱 离皿底。贴壁细胞密度明显降低，脱离皿底的细胞数目增多。贴壁细胞状况不佳，可见胞 质中大量深色颗粒。 1 2 图.10 5#平皿 Hela 细胞衰退期间细胞密度（20 倍物镜） 图 10 注：可见贴壁细胞密度明显降低，仅为50 左右。贴壁细胞状况已不佳，形状变细 长且不规则，大量细胞脱离上浮，即将死亡。 (4) 11 月 18 日 16 时观察 7# Hela 细胞 图.11 7#平皿 Hela 细胞衰退期间细胞形态（40 倍物镜） 图 11 注：1 箭头所指为仍然贴壁的细胞；2 箭头所指为已经死亡或即将死亡的细胞，已 脱离皿底。贴壁细胞密度明显降低，脱离皿底的细胞数目增多。贴壁细胞状况不佳，可见 胞质中大量深色颗粒。 1 2 图.12 7#平皿 Hela 细胞衰退期间细胞密度（10 倍物镜） 图 12 注：可见贴壁细胞密度明显降低，仅为50%左右。贴壁细胞状况已不佳，形状变 细长且不规则，大量细胞脱离上浮，即将死亡或已经死亡。 (三)HE 染色结果 图.13 HE 染色结果（40 倍物镜，明场） 图 13 注：Hela 细胞的细胞核呈现蓝紫色，细胞质呈现粉红色。核内有深染颗粒。胞质 较为均匀，有许多细密的粉红色小点。核周围有较深的红色分布。整张图片的立体感 不强。 五、讨论与结论 (一) Hela 细胞传代 1. 传代前镜检 取出将用于传代的平皿，倾斜培养皿，使得有一小区域的皿底露出，此 时可以看到皿底有灰色污渍状物。 在传代前进行镜检，观察到绝大多数 Hela 细胞处于贴壁状态，细胞呈 现不规则的形状，细胞间相互接触。细胞密度达到 80%左右。 2. 消化前用 PBS 洗涤 在消化前，吸去所有培养基，并用 PBS 洗涤，可以除去细胞代谢产 物，去掉培养液成分以免对细胞外基质的消化造成影响（如实验背景部分 所述，培养液中的血清成分将抑制胰蛋白酶的活性。 ） 。 3. 消化酶消化并镜检 滴加消化酶时直接滴加于细胞表面，而不需要忌讳于冲击到细胞层。因 为消化液体积小，若加于侧面，可能很难覆盖所有细胞；另外消化的目的 之一也是使细胞脱离，所以不需要忌讳冲击细胞层。 消化 2 分钟后取出镜检，可见多数细胞已经呈现圆形，相互分离，说明 细胞外基质已经被消化，达到目的。但细胞仍然黏附于平皿底部。此时考 虑终止消化。因为消化所需要达到的目的即为消化细胞外基质，使细胞相 互分离。消化时间过长可能对细胞产生损害。细胞黏附于平皿底部，这可 以通过吹吸使其脱落。 加入含血清的培养基即可终止消化。 4. 消化后反复吹吸 如前所述，消化后反复吹吸，可使粘附于平皿底部的细胞脱落。在吹吸 时，向平皿底部似有白色物体处吹吸，直到整个平皿底部都变得清凉，此 时绝大多数细胞都脱落。吹吸的另一目的，是使细胞尽量分散开来，避免 大细胞团的存在，大细胞团的存在主要由于这些细胞表面的细胞外基质未 被完全消化。 吹吸后进行镜检，看到多数细胞处于漂浮状态，呈圆形。有数个大的细 胞团。 5. 分盘后 加入飞片的平皿将用于转染，原平皿将用于进行 HE 染色。 离心后用 920 l DMEM+培养基重悬细胞，300 l 转移至原皿，600 l 转移至新皿，20 l 用于计数观察。每次转移前都尽量重悬细胞，因为动物 细胞相比于细菌细胞较重，容易沉底。 新平皿在加入飞片后，先加入 900 l DMEM+培养基，轻轻摇晃，使 得整个平皿浸润；这样，在后来加入 600 l 细胞悬液后就可以不需要再摇 晃使得平皿浸润。加入飞片的平皿不能过多摇晃，以避免飞片的贴皿底一 侧有细胞进入并生长，将来影响转染观察。分好后将新皿放入培养箱中。 原培养皿经过 PBS 润洗数次后，加入 1200 l DMEM+培养基，再加 入 300 l 细胞悬液，轻轻晃匀。分好后进行镜检，可见皿中大量漂浮的细 胞，分散较均匀，细胞呈圆形。有个别大细胞团存在。由于之前冲洗较干 净，未见贴壁细胞。 6. 计数情况 用 5X5 血球计数板进行计数，计四个角及中间的中方格。20 l 细胞悬 液未进行稀释。共计数 4 个视野。计数结果如实验结果中所示。四个视野 所记得的细胞的最大误差为 9.7%（极差/平均值） ，对于本实验而言，这样 的精确值（小于 10%）足以让 4 个视野所计得的数均可以使用，而不需要 剔除离群值。 经过计算得，1ml 细胞悬液中的细胞约为 300 万个。因此，理论上， 转移至新皿中的细胞个数约 180 万个，转移至原皿中的细胞个数约 120 万 个。 （二）Hela 细胞生长周期观察 1. 潜伏期 在 2015 年 11 月 12 日 19 时进行了第一次观察。如图.1 与图.2 所示， 镜下可见大多数细胞处于漂浮状态，细胞呈圆形，较透明。调节焦距，可 见有少量形状不规则的细胞，不随平皿中液体的晃动而晃动，这些细胞应 为已经贴壁的细胞。贴壁细胞形态不再为圆形，而为不规则的形状，胞质 较透明，颗粒很少。另外，在与贴壁细胞同样的深度处也有一些圆形的细 胞，考虑这些细胞应该属于已经沉底，并且将要贴壁。就贴壁细胞的密度 而言，此时观察到的细胞贴壁密度很低，不足 10%。此时培养液呈淡红 色。 由上述观察结果可以判断此时细胞处于潜伏期。 2. 对数期 在 2015 年 11 月 14 日 9 时进行了第二次观察。如图.3，图.4，图.5， 图.6 所示。 在 10X10 镜下观察时，可明显见到贴壁细胞密度相比于潜伏期大幅 度增加。贴壁的细胞形成一个个细胞岛，细胞密度已经达到 60%左右。 在 10X40 镜下观察时，可见细胞岛内的细胞相互接触紧密，形状不 规则。细胞岛中有部分圆形细胞，这些细胞可能是即将进行分裂的细胞， 细胞分裂前将圆化；也可能是即将死亡的细胞，即将死亡的细胞圆化并脱 离皿底。在细胞岛中亦可看见少量正在分裂的细胞，胞质中部发生缢缩； 亦有少量刚完成分裂的细胞，子细胞已处于贴壁状态，细胞为椭圆形，即 将于周围细胞产生紧密接触，细胞个体较小。 由上述观察结果判断细胞处于对数期。 对数期的细胞中，细胞核内数个致密颗粒明显可见，可能为核仁。胞 质内颗粒细小且均匀分布。此时培养液呈淡红色。 3. 衰退期 在 2015 年 11 月 17 日 19 时进行了第三次观察。在 10X10 镜下观察 时，可以看到细胞密度达到 90%以上，部分区域甚至有多层细胞。如 图.7，图.8 所示，在 10X40 镜下观察时，可见有数个由于贴壁细胞脱落产 生的空洞。在贴壁细胞层上方有部分细胞，这些细胞呈不规则的球状，漂 浮于培养液中。这些细胞应该为已经死亡的细胞。贴壁的细胞内，可以明 显见到数个大的深色颗粒，可能为核仁。胞质内的颗粒不明显。已经不能 见到进行有丝分裂的细胞。此时培养液颜色呈淡桔红色。 由上述观察结果判断此时细胞应该刚进入衰退期。 在 2015 年 11 月 18 日 16 时进行了第三次观察。如图.9，图.10， 图.11，图.12 所示。在 10X10 镜下观察时，明显可见大量脱落的细胞以及 由于细胞脱落引起的平皿上的空洞区域；贴壁的细胞之间的间隙变大，贴 壁细胞密度低于 50%，整个平皿中的状态似乎是经历了一场 disaster 之后 的城市，满目疮痍。在 10X40 镜下观察时，可见仍然贴壁的细胞之间的间 隙变大，细胞质内大的致密颗粒变多。漂浮状态的细胞有些呈现圆形，可 能仍未死亡，另有一些呈现不规则形状，应该是已经死亡的细胞。培养基 颜色为淡橘黄色。 由上述观察结果判断此时细胞已经处于衰退期中。 4. 生长周期 由于在培养过程中，一直未进行换液，因此，随着营养物质的消耗， 代谢产物的积累，培养液 pH 值得变化，生长于培养皿中的 Hela 细胞将在 一段时间内经历一个完整的生长周期。潜伏期中，细胞从悬浮状态沉底， 并完成贴壁过程，悬浮状态的 Hela 细胞呈圆形。对于 Hela 细胞而言，不 能贴壁意味着不能分裂增殖，而后死亡。潜伏期末，能贴壁的细胞都发生 了贴壁，贴壁后的 Hela 细胞形态不再而不能贴壁的细胞仍然漂浮，最终将 死亡。在对数期，细胞发生有丝分裂。有丝分裂前细胞圆化，分裂产生的 子细胞继续贴壁，细胞个体较小。分裂产生的许多细胞组成一个个细胞 岛。到对数期末，Hela 细胞的细胞密度可以达到 90%以上，且 Hela 细胞 可以不局限于接触抑制作用，从而生长成多层。Hela 细胞在实验培养条件 下的细胞周期约为 24 小时。平台期前，细胞的状态较好，胞质内颗粒少。 到达平台期时，细胞共同和平生活一小段时间，正常情况下，在平台期可 以做传代操作。由于代谢废物的积累，营养物质的消耗等原因，细胞逐渐 进入衰退期。衰退期中，细胞不同步地逐渐死亡，细胞群体向衰老死亡方 向发展。衰老的细胞胞质内颗粒增多，即将死亡的细胞脱离平皿底部上