总RNA的提取和RT-PCRPPT课件.ppt

实验总RNA的提取与RT-PCR,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心,.,完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法,目的,实验流程,提取原理操作步骤,逆转录原理操作步骤,提取总RNA,合成cDNA第一链,原理体系引物选择,PCR,电泳原理电泳步骤,电泳,第一部分细胞总RNA的提取,操作步骤,1.匀浆化作用8000rpm离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min.2.分离阶段向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。3.RNA的沉淀向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min，12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。4.RNA的漂洗加500微升75乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤，12000g离心5min,弃去乙醇.5.RNA的再溶解空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uLRNase-Free处理水，充分溶解。,原理,10-5mgRNA/细胞mRNA3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。,原理：Trizol的主要成分,Trizol是一种新型总RNA抽提试剂主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。,原理,仪器和主要试剂,1.微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2.TRIpure试剂3.氯仿4.异丙醇5.75乙醇6.无RNase的水(溶液均需用DEPC处理过的水配制),所有的提取过程中都有五个关键点：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源酶的有效抑制；有效地将从和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,关键点,RNA酶污染来源,RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。,防止RNA酶污染的措施,所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,RNA完整性检测,完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。,RNA降解A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。C.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液,常见问题分析,第二部分逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR),仪器和主要试剂,基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管总RNA第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/LTaqDNA聚合酶,操作步骤,采用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKit合成cDNA第一链按下列组分配制RT反应液RT-Mix（包括反转录酶和反应缓冲液）2.5uL引物（包括OligodTPrimer，50uM；Random6mers,100uM)2.5uLTotalRNA5uL反转录反应条件如下3715min（反转录反应）855sec（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在PCR仪中进行,取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂：,PCR反应体系,rTaqMix25uLcDNA第一链产物5uL引物（正、反向引物各10uM)各2uLH2Oupto50ulPCR反应条件如下942min;9430sec;5530sec；7230min-30循环727min4保温,提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。,原理,RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。,反转录酶的选择,随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,引物的选择,PCR反应系统的组成,模板引物dNTP耐热的DNA聚合酶（Taq酶）缓冲液,（一）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,(二)引物引物的设计：使用引物设计软件NTI9.0,PRIME5.0等长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为1821个核苷酸。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primerdimer）。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。(G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物的合成：找专门的生物公司进行引物合成,引物的特异性：引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.21mol/l为宜,（三）Taq酶从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增每100l反应液中含1-2.5uTaqDNA聚合酶为佳保存：-20，避免反复冻存,本实验所扩增的产物DNA片段长度300bp400bp,可取5lPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA-marker评估扩增的特异性。,琼脂糖凝胶电泳,实验材料,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。染料：Gelview、EB电泳缓冲液：TBE琼脂糖DNAMarker5000,溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.,常用染料,实验材料,含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,DNAMarker,实验材料,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,