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分析化学进展 谱学在蛋白质结构/ 构象研究中的应用 蛋白质结构 一级结构是多肽链中氨基酸顺序（MS E P K A I D P K L S T T D R V V K A V P F P P S H R L T A K E V F D ND G K P R V D I L K A H L ）； 二级结构是多肽链骨架的局部空间结构（蛋白质含有- h e l i x 、 - s h e e t 、- t u r n 和R a n d o m C o i l 四种二级结构) ； 三级结构是整个肽链的三维结构； 四级结构是指蛋白质各亚基之间的结合 螺旋每圈含3 . 6 个氨基酸残基 310螺旋每圈含3 个氨基酸残基 折叠每圈含2 个氨基酸残基（ 片层） 转角（反平行片层） 无规则卷曲、 蛋白质二级结构特点氢键稳定（第i 个羰基和第i + 4 个亚胺基）蛋白质二级结构特点氢键稳定（第i 个羰基和第i + 4 个亚胺基） SARs PKHIV 蛋白质构象 Unfolding.mov Puklin-Faucher.S4.movPuklin-Faucher.S2.mov FF o u r i e r TT r a n s f o r m II n f r a r e d SS p e c t r u m（F T - I R ） C i r c u l a r D i c h r o i s m ( C D ) FF l u o r e s c e n c e RR e s o n a n c e EE n e r g y TT r a n s f e r （F R E T ） SS i z e - EE x c l u s i o n CC h r o ma t o g r a p h y （S E C ） 红外光谱法又称为红外分光光度法，它是建立在分 子吸收红外辐射基础上的分析方法。因此，红外光谱 也是一种分子吸收光谱。 1 8 0 0 年英国人Wi l l i a m H e r s h e l 发现红外辐射后， 红外光谱一直是物理学应用较少的研究技术。二十世 纪三十年代，由于对合成橡胶的迫切需求，红外光谱 才得到了化学家的重视和研究，并得到迅速发展。如 今，红外光谱已是一种被广泛采用的定性鉴定有机化 合物、测定分子结构、估算生物大分子结构组成等研 究的有效方法之一。 Fourier Transform Infrared Spectrum （FT-IR） 一般地说，蛋白质含有螺旋( - h e l i x ) 、折叠( - s h e e t ) 、回转 ( - t u r n ) 和无规则卷曲( R a n d o m C o i l ) 等不同类型的二级结构。上 世纪五十年代最早提出了蛋白质红外光谱酰胺I 带1 6 6 0 1 6 5 0 c m - 1 的峰属于螺旋结构、1 6 4 0 1 6 3 0 c m - 1 的峰属于折叠结构的假设。 这一阶段的研究特点主要是定性估算蛋白质二级结构的主要成分。 七十年代发展了若干依赖于大量参数的半定量计算蛋白质二级结 构组成的方法，但确定参数困难，计算复杂，没有能推断应用。 八十年代S u s i 等人分别将F T - I R 二阶导数理论和傅里叶自解卷积方 法应用于蛋白质红外光谱的二级结构分析，使得蛋白质红外光谱 研究进入定量阶段，但由于水在酰胺I 带有较强的红外吸收，一 般研究只能在重水环境下进行。 九十年代蛋白质红外光谱超薄样品池垫片（6 7 . 5 m）的应用 以及仪器公司为蛋白质红外光谱设计了专门分析软件，D o n g 等 用十余种已知X 射线衍射结构的蛋白进行红外光谱分析，建立了 红外光谱定量分析蛋白质在H 2 O环境中的二级结构方法，并可以 此来研究蛋白质的构象变化。 红外光谱红外光谱定性分析定性分析化合物化合物C8H10红外谱图红外谱图 推论二甲苯 红外光谱红外光谱定量分析定量分析比尔定律比尔定律 蛋白质红外光谱可分析:蛋白质红外光谱可分析: 二级结构组成分析二级结构组成分析 H / D 交换H / D 交换 蛋白稳定性( 变性)蛋白稳定性( 变性) 蛋白与蛋白/ 蛋白与小分子结合所引起的结构 变化 蛋白与蛋白/ 蛋白与小分子结合所引起的结构 变化 酰胺基团的特征振动酰胺基团的特征振动 名称波数/ C M- 1振动模式 酰胺A3 3 0 0N- H 伸缩振动 酰胺B3 1 0 0费米共振 酰胺I1 6 6 0C =O伸缩振动 酰胺I I1 5 7 0N- H 弯曲振动和C - N伸缩振动 酰胺I I I1 3 0 0C - N伸缩振动和N- H 弯曲振动 酰胺I V9 3 0O=C - N面内弯曲振动 酰胺V7 3 0N- H 面外弯曲振动 酰胺V I6 0 0C =O面外弯曲振动 Absorbance Amide I: C=O stretching Amide II: NH bending Secondary Derivative spectrum -C=O-H-O 13001400150016001700180019002000 Absorbance Col 21 vs Col 22 Wavenumber (cm-1) 160016201640166016801700 d2A/d2 Amide I Amide II Wavenumber (cm-1) 160016201640166016801700 -d2A/d2 -Turn -turn -helix -sheet random side chain 二级结构稳定基础：肽链骨 架中第i个羰基氧原子与i+4 亚胺基上氢之间的氢键 螺旋-每圈螺旋含3.6个残 基; 310螺旋-每圈螺旋含3个 残基; 折叠-每圈含2个残基 各个波谱段的红外吸收所对应的二级结构类型各个波谱段的红外吸收所对应的二级结构类型 平均频率(cm-1)所对应的二级结构 16241.0折叠 16272.0折叠 16332.0折叠 16382.0折叠 16421.0折叠 16482.0无规则卷曲 16562.0螺旋 16633.0310螺旋 16671.0回转 16751.0回转 16802.0回转 16852.0回转 16912.0回转 16962.0回转 No absorbance at 2000-1750 cm-1 H/D exchange: Amide I / Amide II Protein FT-IR Spectrum Two standards EPAC H-D exchange (with 300 uM cAMP) Wavenumber (cm -1) 130014001500160017001800 Absorbance 0.00 .05 .10 .15 .20 H2O 1 3 5 10 30 60 120 180 D2O FT-IR spectra of PK Subtraction of H2O will bring big error in absorbance spectrum Small error in second derivative spectrum Wavenumber (cm-1) 1300135014001450150015501600165017001750 Absorbance Wavenumber (cm-1) 15801600162016401660168017001720 Absorbance/Wavenumber2 PK PK - negative error PK - positive error PK spectra 1400150016001700180019002000 Absorbance Wavenumber (cm-1) 160016201640166016801700 d2A/d2 H/D exchange Exchanged Time (min) 020406080100120140160180200 Ratio of unexchanged proton 0.00 .05 .10 .15 .20 .25 .30 H/D exchange Wavenumber (cm-1) 13001400150016001700180019002000 Absorbance 1674 CRP+0.8 M GdnHCl 0.8 M GdnHCl CRP (10 x) A B C FT-IR spectra in the presence of denaturant Have to get good absorbance spectrum first Be careful, when sample in the presence of GdnHCl ! Questions: 因H2O在1650cm-1 周围有强吸收，如何确定本底已经彻底减去？ 样品厚度（pathlength）？ H/D exchange: Amide I / Amide II多少？不同次实验其比值是否一致？ 对于1700-1600cm-1以外光谱：来自于何种化学键的何种振动？ 对于蛋白质的吸收光谱：任何蛋白均有相近的吸收光谱？ 在变性剂存在下， 1700-1600cm-1吸收是否光滑？ absorbance at 2000-1750 cm-1? Circular Dichroism (CD) 光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收不同，使 左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光，这种现 象称为圆二色性 习惯上把对左、右圆偏振光的吸光率之差称为圆 二色性 圆二色谱椭圆度与波长之间的关系图 多功能圆二色光谱仪 型号：MOS-450产地：法国型号：A v i v 4 0 0 产地：美国 圆二色样品池 蛋白用量：远紫外5微升（浓度小于0.5mg/ml），近紫外1毫升 1 、1 0 0 %的- 螺旋1 、1 0 0 %的- 螺旋 2 、1 0 0 %的- 折叠2 、1 0 0 %的- 折叠 3 、1 0 0 %的无规卷曲3 、1 0 0 %的无规卷曲 远紫外区远紫外区(F a r - U VF a r - U V )蛋白质的圆二色性曲线蛋白质的圆二色性曲线 远紫外区是肽键的吸收峰范围，反映了蛋白质主链的构象。 近紫外区是芳香残基/侧链的吸收峰范围，反映了蛋白质侧链 的构象。 近紫外区近紫外区(Ne a r - U VNe a r - U V )蛋白质的蛋白质的CD曲线曲线 根据圆二色性判断蛋白质主链构象根据圆二色性判断蛋白质主链构象 蛋白质的圆二色性曲线是相应各组分的代数和： f + f + f R =1 蛋白质各个构象的圆二色性在各个波长时的数值也 是加和的： = f , + f , + f R R , f 、f、fR 分别是- 螺旋、- 折叠和无规卷曲等结构所占百分数， 是波长处的椭圆度， , 、 , 、 R , 是波长处当结构分 别为1 0 0 %的- 螺旋、1 0 0 %的- 折叠、1 0 0 %的无规卷曲时的椭圆度。 利用这一公式，只要选择3 个不同的波长测蛋 白质的椭圆度，便得到一组方程组： 1 = f , 1 + f , 1 + f R R , 1 2 = f , 2+ f , 2+ f R R , 2 3 = f , 3+ f , 3+ f R R , 3 由此可方便解出f 、f、fR ，也确定了蛋白质主链 的构象。 近紫外区蛋白质的圆二色性近紫外区蛋白质的圆二色性 在近紫外区( 2 4 5 - 3 2 0 n m) ，蛋白质的圆二色性各谱 峰之间有重叠，分析相当困难 此区域的谱峰由侧链基团贡献，能敏感反映蛋白质 构象的细微变化 A p p l i c a t i o n o f C D 估算蛋白质二级结构(杨氏公式、 k2d, ?) 蛋白质稳定性（去折叠过程既能 量变化、CD随温度变化 蛋白与小分子的结合所引起的结 构变化 Near UV CD 估算蛋白质二级结构 C D s p e c t r o s c o p y o f 西尼罗等病毒 蛋白质稳定性（去折叠过程既能量变化、CD随温度变化 CD随温度变化 C D 是什么？蛋白指纹？ C D 是在蛋白质二级结构中被广泛错误 应用、在蛋白能量和结构变化及有机小 分子研究中能提供有效信息的一种光谱 技术 FRET在蛋白质构象研究中的应用 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 发现于上世纪五十年代，应用于九十年代 荧光产生的原理 能量转移( E n e r g y T r a n s f e r , E T )能量转移( E n e r g y T r a n s f e r , E T ) 辐射能量转移 无辐射能量转移 共振能量转移共振能量转移 交换能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) DonorAcceptor ET 6 0 1 = r R k D T TD T k k E + = 1 Rate of energy transfer(kT) rsteroF . R0is thedistance at which half of the energy is transferred (20-50) 66 0 6 0 rR R E + = Efficiency of energy transfer(E) Dis the decay time of the donor in the absence of acceptor rsteroF . Theory r distance between donor and acceptor Example. Styrer and Haugland showed that FRET could be used as a spectroscopic ruler FRET is always used to measure distances on the order of R0,Though, it is better suited for detecting changes in distance (conformation) Applications Genetic engineering for probes and labeling Nature structural biology, 2000(7),9:730-734 Strategy Acceptor Aonor Distancein the presence and absence of XX 1 MSEPKAIDPK LSTTDRVVKA VPFPPSHRLT AKEVFDNDGK PRVDILKAHL 51 MKEGRLEESV ALRIITEGAS ILRQEKNLLD IDAPVTVCGD IHGQFFDLMK 101 LFEVGGSPAN TRYLFLGDYV DRGYFSIECV LYLWALKILY PKTLFLLRGN 151 HECRHLTEYF TFKQECKIKY SERVYDACMD AFDCLPLAAL MNQQFLCVHG 201 GLSPEINTLD DIRKLDRFKE PPAYGPMCDI LWSDPLEDFG NEKTQEHFTH 251 NTVRGCSYF Y SYPAVCEFL Q HNNLLSILRA HEAQDAGYRM YRKSQTTGFP 301 SLITIFSAPN YLDVYNNKAA VLKYENNVMN IRQFNCSPHP YWLPNFMDVF 351 TWSLPFVGEK VTEMLVNVLN ICSDDELGSE EDGFDGATAA ARKEVIRNKI 401 RAIGKMARVF SVLREESESV LTLKGLTPTG MLPSGVLSGG KQTLQSATVE 451 AIEADEAIKG FSPQHKITSF EEAKGLDRIN ERMPPRRDAM PSDANLNSIN 501 KALTSETNGT DSNGSNSSNI Q Calcineurin A CN and CaM Constructs? Thiol Modification Fluorescence Spectra of Donor and acceptor Donor Acceptor Thiol Modification 50 uM protein in Buffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM Mg2+, 20 uM TCEP, pH 7.5); No DTT, little TCEP; Oxygen free (better!); 10-fold excess of dye; At 4 C overnight (!) G-25 (twice) to remove excess of dye (extensive dialysis against buffer) Dye cons: Absorbance spectrum; Protein cons: Bradford assay; Add buffer into protein; Aliquot at -70 C. IF FRET happens between CN and CaM Measuring distances R6=R06(1-E)/E E transferred energy; R distance between donor and acceptor; d life time of the donor in the absence of acceptor; da life time of the donor in the presence of acceptor. E=1- d/ da R0=9.7x103(Jk2n-4q)1/6() R0 distance between donor and acceptor at which the 50% energy is transferred; J Overlap integral of absorbance spectrum and emission spectrum; n Assumed to be 1.33; k2 Assumed to