DNA重组 (3).ppt

第五章DNA重组,同源重组Homologousrecombination位点专一性重组Site-specificrecombination转座重组Transposition,生物进化需要可遗传的变异不断产生,变化的根本原因是突变,但就每个个体而言发生突变的几率毕竟很低。涉及到的基因数目非常有限，如果只有突变而没有不同个体间的基因交流，则生物体难以迅速组装产生最能适应环境条件的基因组合。而且，通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性，从而为选择奠定物质基础。,第一节同源重组Homologousrecombination,同源重组指由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程。真核生物非姐妹染色单体之间的交换，姐妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合、噬菌体的重组都属于这一类型。其中，E.coli等细菌的同源重组又称为依赖RecA的重组。,真核生物同源重组也称交换（crossingover），是指减数分裂（meiosis）过程中染色体间遗传物质的交换。其特征是发生在同源DNA序列之间。重组酶能以两个DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换。,特征,涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成存在重组热点需要重组酶单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号,一、同源重组的分子模型,1、断裂-复合Breakageandreunion,2、异源双链在重组位点上，每个双链都有一个由两个亲本DNA分子中的一股单链共同组成的双链区域，这段区域称为异源双链DNA（heteroduplexDNA）,3、分支迁移两个双螺旋形成的交叉连接很容易以拉链式效应扩散，也就是链交换可沿着双链滑动，这个过程称为分支迁移（branchmigration）,4、Holliday结构,重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点称为Holliday结构。,5、连接分子的拆分,链交换形成的连接分子必须拆分（resolution），彼此分离为双链DNA分子。由于交联在一起的两条双链DNA分子实际上处在不断地异构化中，切口可能在两对同源链中任意一对上发生。,根据链裂断切开的方式不同，得到的重组产物也不同。如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，则称为拼接重组体（splicerecombinant），此种重组又叫做交互重组（reciprocalrecombination）。但如果切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，则称为片段重组体（patchrecombinant）。,连接分子可以以两种交替方式进行拆分，两侧基因或是发生交互重组，或是无重组发生。但无论哪种拆分方式都说明一个原则，即链交换后总会在两条DNA分子上留下一段异源双链区，但侧翼序列的重组未必与之同时发生。不同生物体同源重组的具体过程虽有不同，但基本步骤大致相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区，就可以发生重组。,二、细菌的基因转移与重组,细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境。细菌的基因转移主要有4种机制：接合（conjugation）、转化（transformation）、转导（transduction）、细胞融合（cellfusion）。,1、细菌的接合作用,细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为接合作用。供体细胞为雄性，受体为雌性。通过接合而转移DNA的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子（fertilityfactor），简称性因子或F因子。,致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。,在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf)菌株，若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+,F质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F因子，F因子携带的基因可在受体菌表达。,2、遗传转化,遗传转化（genetictransformation）是指细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状的改变现象。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞（competentcell）。自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参与，实验室常用高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态。,3、细菌的转导,转导（transduction）是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。4、细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。,三、大肠杆菌重组的分子基础,在细菌重组反应中活性最为明显的是由大肠杆菌染色体上rec基因和ruv基因编码的一些酶。其中，主要有RecA蛋白，RecBCD酶，RuvABC酶等到。,1、RecA蛋白,RecA蛋白是催化重组基本反应的酶。RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化（assimilation）。单链同化是一个分子的单链侵入到另一个分子的双螺旋上，通过取代双螺旋上的原始链而形成异源双链。当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上形成螺旋状纤丝（helicalfilament）。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。,RecA催化的单链同化,RecA蛋白分子质量为38000da，它与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含6个单体，螺旋直径10nm，碱基间距0.5nm。此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以允许转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来,RecA蛋白引起DNA同源重组的模型,2、RecBCD酶,亦称核酸外切酶V，它通过chi序列识别靶位点，这种酶的各个亚基是由recB，recC，recD基因编码的产物。它是一种有效降解DNA的核酸酶，可以在单链结合蛋白的存在下松开DNA双链，同时还具有ATP酶活性，它在重组中的作用是提供具有3-末端的单链区域。,Chi位点GCTGGTGGCGACCACCsites,3、RuvABC,RuvA识别Holliday结构连接点。RuvB是一种ATP酶，为分支迁移提供动力。RuvC是专一识别Holliday结构连接点的核酸内切酶，它在体外切断连接点以拆分重组中间体。,在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。（a）RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。（b）RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点；（中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心，RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。（右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。（c）RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。（d）假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。,RecBCD和RecA的共同作用,单链侵入Single-stranduptake链交换Single-strandassimilation,重组修复,在复制叉处重组水平的修复,第二节位点特异性重组,位点特异性重组（Site-specificrecombination）需要在特定的位点上发生断裂和重接，从而产生精确的重排。位点特异性重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节、发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短（20200bp）DNA序列内（重组位点），并且有特异的酶（重组酶）和辅助因子对其识别和作用。,位点特异性重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合,一、噬菌体DNA的整合与切除,噬菌体DNA进入宿主大肠杆菌细胞后存在溶原和裂解两条途径，二者的最初过程是相同的，都要求早期基因的表达，为溶原和裂解途径的歧化做好准备。两种生活周期的选择取决于CI和Cro蛋白相互拮抗的结果。CI蛋白抑制除自身外所有噬菌体基因的转录，如果CI蛋白占优势，溶原状态就得到建立和维持。Cro蛋白抑制CI基因的转录，它占优势噬菌体即进入繁殖周期，并导致宿主细胞裂解。噬菌体的整合发生在噬菌体和宿主染色体的特定位点，因此是一种特异位点重组。整合的原噬菌体随宿主染色体一起复制并传递给后代。但在紫外线照射或升温等因素诱导下，原噬菌体可被切除下来，进入裂解途径，释放出噬菌体颗粒。,整合和切除过程是在细菌DNA和噬菌体DNA专一性的附着位点(attachmentsite,att)上进行的,细菌的附着点称attB,由序列BOB组成,噬菌体的附着位点称attP,由序列POP组成。其中O序列是attB和attP所共有的，所以称为核心序列（coresequence)重组后形成两个新att位点，attL(BOP)和attR(POB),位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别。尽管整合和切除过程是可逆的，但反应导向则由不同条件决定的。整合过程要求在attB和attP之间进行识别,而切除过程则在attL和attR之间识别,1、整合反应,噬菌体编码一种酶整合酶（integrase,INT)，它能切断，并能使它重新连接从而直接将噬菌体插入大肠杆菌染色体中，通过两条的专一位点上的重组合并成一个环状分子整合作用需要由大肠杆菌编码的整合宿主因子（integrationhostfactor）的共同作用,模型说明attP和attB部位进行了交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交。DNA交换点之间的距离为7bp，,在位点专一性重组中，有关蛋白质结合在att部位的特定位点上。当INT和IHF蛋白结合在attP位点时形成的复合物称为整合体（intasome）。整合体就是捕获attB的中间体。INT蛋白分子可能作为整合体的一部分结合到attB的核心位点上，说明attP和attB的最初识别不是直接取决于DNA的同源性，而是由INT蛋白识别两个att序列的能力来决定的，当需要链交换反应时，同源序列在此阶段才显得重要。,2、切除反应（excision）,当诱发原噬菌体生长时，整合作用发生逆转，这个过程称为切除（excise）。切除需要Xis蛋白，它抑制整合作用。INT，XIS，IHF连在一起覆盖了全部attP，从而不利于进行整合反应。,当噬菌体进入溶源状态时优先发生整合反应。而当噬菌体进入裂解周期时则切除反应占优势，通过控制INT和XIS的存量发生适当的反应。,二、细菌的特异位点重组,鼠伤寒沙门氏杆菌（Salmonellatyphimurium）由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。遗传分析表明，这种抗原相位的改变是由一段995bp的DNA，称为H片段（Hsegment）发生倒位所决定。,hix基因编码特异的重组酶，即倒位酶（invertase）Hin。该酶为相对分子质量22000亚基的二聚体，分别结合在两个hix位点上，并由反向刺激因子Fis（factorforinversionstimulation）促使DNA弯曲而将两个hix位点联结在一起，DNA片段经断裂和再连接而发生倒位。rH1表达产物为H1阻遏蛋白，当H2基因表达时，Hl基因被阻遏；反之，H2基因不表达时，H1基因才得以表达,免疫球蛋白基因的重组,第三节Transposition(转座作用）,基因组可通过获得新序列而进化，也可通过现存序列的重排实现这一目的。无论是原核生物还是真核生物，转座子或转座元件（transposonortransposableelement)的移动提供了基因组变化的潜在可能。,一、转座子（transposon，Tn）,基因组上不必借助同源序列就可移动的DNA片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。在原核生物和真核生物中都发现了经由DNA移动的转座子。,转座过程有以下特征：,能从基因组的一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子；不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA），而是在基因组内由一个部位直接转移到另一部位；转座子编码其自身的转座酶，每次移动时携带转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因；转座的频率很低，且插入是随机的，不依赖于转座子（供体）和靶位点（受体）之间的任何序列同源性；转座子可插入到一个结构基因或基因调节序列内，引起基因表达内容的改变，如使该基因失活，如果是重要的基因则可能导致细胞死亡。,二、转座子的类型和结构特征,所有的转座子都有两个结构特征：（1）两端有20-40bp的反向重复序列（invertedrepetitivesequence,IR)（）具有编码转座酶（transposase)的基因,这种酶催化转座子插入新的位置。,在原核生物中已发现两种类型的转座子：（1）简单转座子（simpletransposon）又称为插入序列（insertionsequence，IS）。（2）复合转座子（compositetransposon）,（1）插入序列（IS）,插入序列是最简单的转座子，IS因子是一种较小的转座因子，长度为7501550bp，只含有与转座有关的酶基因，不含抗药性等其他基因，其两端都具有1525bp的反向重复序列（invertedrepeat，IR）。可以在不同的复制子间转移位置，以非正常重组的方式从一个位点插入到另一个位点，从而对该位点的基因的结构与表达产生多种遗传效应。每一类型都以IS加鉴定类型的编号来表示。但后来的类型编号只反映它们的分离历史，并不表示至今所分离的插入序列的总数,IS因子本身不具有表型效应，只有当它转座到某一基因附近或插入某一基因内部后，引起该基因失活或产生极性效应时，才能判断其存在。所引起的效应与其插入的位置和方向有关。转座时，宿主靶部位双链被交错切开，经修复后插入序列两侧形成短的正向重复。靶序列通常是任意的，但交错切开的长度是固定的，一般为59bp。,（2）复合转座子（Tn）,一些转座子除了除了有转座酶基因外，还携带药物抗性(或其他)标记。这些转座子以Tn和数码来命名。其中一类是由携带药物标记的中央区域和两侧的臂(arms)组成的复合因子(compositeelements)。有的转座子的重复顺序就是IS，复合转座子也和IS一样，能从一个位点转座到另一个位点。,二、转座子的转座机制,转座的机制,转座作用的机制仍可分为三种不同类型：即复制型，非复制型，保守型其中复制型转座需要两种酶，转座酶和解离酶,复制转座作用引起了转座子的一个复制，它插入到一个接受位点。捐赠位点保持不变，以致捐赠者和接受者都有转座子的一个复制,非复制转座作用允许一个转座子像物体一样从捐赠们点移动到接受位点，这样就在捐赠位点留下了一个断裂。,保守的转座作用描述了另一种非复制结果，因子在捐赠位点被切除，然后通过一连串的反应插入到一个靶位，这样每一个核苷粘合都被保留。,复制转座作用通过一个共合体进行,非复制转座作用借助断裂和重聚进行,TnA转座作用：复制型转座需要转座酶和分解酶,tnpA基因产物是一个转座酶TnpR基因的产物具有二重功能，蛋白担任着基因抑制子表达和供应分解酶的功能。TnpR抑制了所有tnpA和自己的基因的转录。,共合体结构的解离部位称为res，即是解离酶的结合部位。位点I是遗传上作为res部位的区域，它的缺失将使解离反应完全不能进行。然而解离反应也与部位II和III有关。因为其中任何一个部位缺失，解离反应都变得很弱。,三、转座子转座的特征,（1）转座不依赖于靶序列的同源性（2）转座后靶序列重复（3）转座子的插入具有专一性（4）转座具有排他性（5）转座具有极性效应（6）活化临近的沉默基因（7）区域性优先,转座频率的调控,对于细胞来说，控制转座子调换的频率是很重要的，转座子必须能维持某一最小的移动频率，因为太大的频率会破坏宿主细胞，研究表明每一个转座子都有控制它自身调换频率的机制。,通过反义RNA的翻译水平控制,IS10R外侧边缘两个启动子PIN弱启动子控制IS10R的转录POUT强启动子右向转录宿主DNAINRNA和OUTRNA有36b