响应面法优化林蛙油酶解工艺及产物分子量分布研究 (1)

2 6 8 2 0 0 8 ，V o i 2 9 , N o 0 9良晶科学工艺技术 响应面法优化林蛙油酶解工艺及 产物分子量分布研究 胡耀辉，孙建忠，申丽萍，徐云 ( 吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 1 3 0 11 8 ) 摘要：采用B o x B e h n k e n 中心组合设计和响应面分析，对木瓜蛋白酶酶解林蛙油的主要影响因素即底物浓度、 加酶量、酶解温度、时间、p H 值进行多项式回归模型建立和最优化，同时对酶解产物进行质谱分析检测。结 果表明最佳工艺条件为：底物浓度1 ，加酶量1 0 0 0 U g ，温度6 0 1 2 ，时间3 O h ，p H 6 5 ；产物经激光解吸电 离飞行时间质谱仪分析，水解液中含有四种不同的物质，分子量分别为7 1 2 4 、8 2 6 6 、11 0 1 2 和1 3 2 6 1 D 。 关键词：响应面；酶解；分子量 S t u d yo nO p t i m i z a t i o no f E n z y m o l y s i sT e c h n o l o g yo f F o r e s tF r o gO i lb yR e s p o n s eS u r f a c eM e t h o da n d M o l e c u l a rW e i g h tD i s t r i b u t i o no f I t sH y d r o l y s a t e H UY a o h u i ，S U NJ i a n z h o n g ，S H E NL i p i n g 。X UY o n ( C o l l e g eo f F o o dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g ，J i l i nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ，C h a n g c h o n 1 3 0 11 8 ，C h i n a ) A b s t r a c tB o x - B e n h n k e n Sc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d , p o l y n o m i a lr e g r e s s i o nm o d e lo nt h em a i n i n f l u e n c i n gf a c t o r st oe u z y m o l y s i so f f o r e s tf r o go i lw i t hp a p a i ns u c h 嬲s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n , e ! n z y m ed o s a g e e n z y m o l y s i s t e m p e r a t u r e ，t i m ea n dp Hv a l u ew a s e s t a b l i s h e da n dt h e yw a ! eo p t i m i z e d M e a n w h i l e ，i t se n z y m a t i ch y d r e l y s a t e sw e r ed e t e r m i n e d b ym a s ss e p e c t r o m e t r y T h eo p t i m a le n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o n sa r ed e t e r m i n e da s ：s u b s W a t ec o n c e n t r a t i o n1 c n z y n l e d o s a g e1 0 0 0U g ，t e m p e r a t u r e6 0 ，t i m e3 0h ，p H6 5 A c c o r d i n gt od e t e r m i n a t i o nr e s u l t so f l a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h m a s ss p e c t r o m e t e r , t h e h y d r o l y s a t e s o f f o u r d i f f e r e n t c o n g x m O m ，w h o s e m o l e c u l a r w e i g h t a r e 7 1 2 4 ，8 2 6 6 ，1 1 0 1 2 a n d 1 3 2 6 1D r e s p e c t i v e l y K e yw o r d s ：r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ；e n z y m o l y s i s ：m o l e c u l a rw e i g h t 中图分类号：Q 8 1 4 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 0 0 8 ) 0 9 0 2 6 8 0 5 林蛙油主要成分是蛋白质( 约占6 0 ) 、氨基酸、脂 肪酸、脂溶性维生素、碳水化合物、磷脂、雌二醇、 孕酮等【1 】，而且氨基酸种类丰富，在深加工方面主要为三 大类产品，即营养保健品、药品和化妆品。若将林蛙油 经生物工程手段处理，提高其吸收利用率，再辅之以其 它物质组方加工成保健食品，将大大提高经济价值。 目前，人们主要多以传统费时的蒸煮、浸泡等方 法食用，加工产品较为单一，仅限于林蛙油口服液、 胶囊和饮料等，从而使林蛙油的营养成分没有被人体充 分的吸收利用，营养损失严重，造成资源浪费。在肽 健康和补肽热的今天，没有从根本上满足人体缺乏外源 肽的需要，缺乏对林蛙油方便、快捷产品的深度开发 研究。针对目前存在的问题，本研究采用酶解法对林 蛙油进行水解，将蛋白质分解成低分子量的具有生物活 性的肽类物质，使之更易被人体消化和吸收。通过B o x B e n h n k e n 的中心组合实验设计，对实验数据进行响应 面方法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，R S M ) 分析，对 拟合多项式回归模型进行了较为系统的分析，得到酶解 林蛙油的最佳条件。酶解产物在凝胶分离纯化的基础 上，利用激光解吸电离飞行时间质谱分析检测，确定 肽类物质的分子量。 1 材料与方法 1 1 材料与试剂 林蛙油长白山北亚药业有限公司。 木瓜蛋白酶( 分析纯)上海楷洋生物工程有限公司。 三氯乙酸( 分析纯) a - 氰基- 4 一羟基肉桂酸( 色谱纯) 。 1 2仪器与设备 收稿日期：2 0 0 8 0 5 - 2 1 基金项目：国家科技部农业科技成果转化资金项( 0 3 E F N 2 1 2 2 0 0 0 7 0 ) 作者简介：i 愀( 1 9 5 1 一) ，男，教授，研究方向为食品生化工程及功能性食品。E - m a i l ：h u y a o h u i 1 6 3 v i p c o r n 万方数据 1 = 艺技术良晶科学2 0 0 8 , V o L 2 9 , N o 0 92 6 9 L D I 1 7 0 0 型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 美国L i n e a rS c i e n t i f i c 公司；F D 一1 D 一5 0 型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；D E L T A3 2 0 型p H 计梅 特勒托利多仪器有限公司；U V 一2 6 0 0 型紫外分光光度计 尤尼柯( 上海) 有限公司；B S Z 1 6 0 型自动部分收集器 上 海青浦沪西仪器厂；B 一1 型蠕动泵上海统一生化仪器 厂。 1 3 方法 1 3 1 水解度H ) 测定 采用p H S t a t 法【2 】，分别对影响水解度的主要因素加 酶量、底物浓度、酶解时间、温度、P H 值等进行讨 论。 1 3 2响应曲面法因素水平表的确定 3 - s 在进行响应面方法优化实验之前，先确定实验目 的，找出影响结果的关键因素。然后将各个关键因素 设为自变量，将其换算成编码值，具体方法如下： g i m ( X i X 印) A ) ( i ，( i - l ，2 ，3 ，k )( 1 ) 式中x i 是自变量的编码值，x ；是自变量的真实值， X 。，是自变量中心点的真实值，x t 是自变量的真实值 的步长，相当于编码值的一个单位。 响应值用因变量Y t 来表示，自变量和因变量的关系 可用下面的二次多项式来表示： Y i = b o + b i x i + i j b i j x i x j + b 硒2 ( i j )( 2 ) 式中，b 是多项式系数的估计值，x i 代表编码值。 上述的二次多项式用S A S 统计软件进行计算和分析，得 到最大的响应值以及与之相对应的变量值。 1 3 3M A L D I T O FM S 分析法【6 】 采用氮激光器波长为3 3 7 n m ，脉冲宽度3 n s 。 检测质量范 ( m z ) O - - 4 0 0 0 ，排斥电压3 0 k V ，吸引 电压9 3 k V ，检测器电压一4 7 5 k V ，真空度1 1 0 4 P a ， 基质为仅氰基4 羟基肉桂酸。 2 结果与分析 2 1加酶量对林蛙油酶解反应的影响 1 2 l O 8 6 4 2 0 o3 06 0 9 01 2 0 1 5 01 8 02 1 0 2 4 02 7 03 酶解时间( m i n ) 图1 加酶量对水解度的影响 F i g 1 E f f e c t so fe n z y m ed o s a g eo nD H 由图1 可知，在一定范围内，随着加酶量的增加， 水解度( D H ) 也在逐渐的增加，但加酶量达到一定值趋于 饱和后，D H 的增量变化微小，虽然随加酶量的增加， D H 在不断地增加，但变化幅度不大；从经济学角度分 析，确定加酶量在1 0 0 0 U g 附近较为合适。 2 2 底物浓度对林蛙油酶解反应的影响 1 2 l O 8 6 4 2 0 o3 0 6 0 9 01 2 01 5 01 8 0 2 1 02 4 0 2 7 03 0 0 酶解时间( m i r O 图2底物浓度对水懈度的影响 F i g 2 E f f e c t so fc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t eo nD H 由图2 可知，随着底物浓度的增加，D H 逐渐减小； 初始浓度越小，酶解反应的初速度越大，水解度也越 高。由于林蛙油本身在水溶液中随着浓度的增加黏度急 剧变大，使酶与底物接触几率减小，阻碍了酶解反应 的进行，导致水解度变小。 2 3 温度对林蛙油酶解反应的影响 1 1 。2 8 喜。6 2 O O3 06 09 01 2 0 1 5 01 8 02 1 0 2 4 0 酶解时间( r a i n ) 图3 不同温度对水解度的影响 F i g 3 E f f e 吐so ft e m p e r a t u r eo BD H 由图3 可知，随着酶解温度的升高，D H 逐渐增大， 当温度达到6 5 时，水解度先增大后趋于平缓，最大 水解率还没达到6 0 时的水平，说明木瓜蛋白酶的最适 温度在6 0 附近；由于木瓜蛋白酶本身是一种耐高温 酶，温度在一定范围内波动时，对其影响较小。酶解 温度对酶的初速度影响不大。 2 4 p H 值对林蛙油酶解反应的影响 1 ： 4 6 2 O 03 06 09 01 2 01 5 01 8 02 1 0 2 4 0 酶解时间( m 岫 图4 p H 值对水解度的影响 F i g 4 E f f e c t so fp Hv a l u e so nD H 万方数据 2 7 0 2 0 0 8 , V 0 1 2 9 ，N o 0 9艮品科学 工艺技术 由图4 可知，随着p H 值的减小，酸度的增加，D H 有逐渐增大的趋势，开始曲线较平缓，12 0 r a i n 以后增 幅较大；因为蛋白酶本身也是一种蛋白质，在极性p H 值条件下酶活力也会下降。因此，结合p H 值对D H 的 影响，可以确定p H 值为5 5 左右较合适。 2 5 B o x - B e h n k e n 中心设计及其响应面法优化木瓜蛋白 酶酶解工艺 在单因素试验的基础上，采用B o x B e h n k e n 中心设 计原理，对影响木瓜蛋白酶酶解反应的加酶量( U g ) 、底 物浓度、温度和p H 值等因素，采用S A S 8 1 分析软件设 计了四因素三水平中心组合设计，试验因素水平设计及 结果见表1 、2 。 表1 木瓜蛋白酶B o x - S e h n k e n 设计试验因素水平及其编码表 T a b l e1B o x - B e h n k e nd e s i g nt e s tf a c t o r sa n dl e v e l sa n dc o d i n g t a b l eb yp a p a i n 因素编码值 水平 加酶量( U g ) x l 8 0 0i o o o1 2 0 0 底物浓度( ) X 20 511 5 温度( )舄 5 56 06 5 E 旦笪 垫! ：! ：!：! 注：共有2 7 个试验，其中2 4 个为析因试验，3 个为中心试验，以估 计误差。 2 5 1 不同因素对水解度的影响 为考察各因素对水解度的影响，以D H ( ) 为指标 ( Y ) ，利用S A S 8 1 分析软件对表2 的试验结果进行分析， 得到四因素与D H ( ) 之间的回归方程如下： Y = 2 5 4 4 9 6 8 + 0 0 1 6 1 2 5 X 1 - - 0 0 8 1 8 3 2 X 2 - - 0 0 0 3 0 4 4 X a - - 0 0 2 2 8 9 9 X 4 - - 0 0 4 7 6 2 X 1 2 + O 0 2 9 9 0 5 X l X 2 + 0 0 3 4 2 0 8 X I X a 一0 1 3 4 6 8 5 X 2 2 0 1 2 0 5 7 1 X a 2 0 0 9 11 6 7 X 4 2 对回归模型进行方差分析，结果见表3 。从中可以 看出，回归模型达到显著水平( p 0 0 5 ) ，而误差项不显 著，说明回归方程与实际情况吻合的较好，实验误差 小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进 行分析。回归模型各项的方差分析结果还表明，一次 项、二次项都有较显著影响，所以响应值的变化相当 复杂，各个具体试验因素对响应值的影响不是简单的线 性关系。由回归方程可知，加酶量对D H ( ) 有正影响， p H 值、温度、底物浓度对D H ( ) 有负影响，回归模 型中显示了多项交互作用，其中作用显著的是X2 ， x 2 x 2 ，X3 x3 ，X x 4 。因此，在一定范围内可调节温 度、P H 值、底物浓度和加酶量的关系，使水解度达 到所需水平。 从表中可以看出影响水解度各因素按影响大小排序依 次为底物浓度X 2 、p H 值x 、加酶量X - 、水解温度x ， 其中底物浓度对水解度的影响达到极显著水平( p 0 0 1 ) 。 2 5 2各因素间交互作用对D H 的响应面分析 表3 木瓜蛋白酶洲( ) 方差分析表 T a b l e3A N O V Af o rt h ef i r e dq u a d r a t i cp o l y n o m i a lm o d e lo n d e g r e eo fh y d r o z a t i o no fp a p a i n 注：表示在0 = 0 0 5 水平上显著；”表示在d = O 0 1 水平上极显著 通过S A S 8 1 软件分析，如表3 所示，以极显著项 表一一一。：， 8 3 J 2 名3 9 3 石思2 7 4 名6 4 石3 6 4 9 五9 名 殳m m m m n m 也n m殳殳加o：m m 殳殳& s j n n O 1111O O O O O O O O 1 1 O O 0 O 1 1 l O O O O 1111O O O O O 0 O 、 O O O O O O O O 1 1 l 0 O O O 1 1 O O 0 l O O O O1，l O O O O 1 1 O O O O 0 O 0 4 ，6 7 0，m屹H：2插博垮加扒龙M”拍 万方数据 1 = 艺技术食品科学 2 0 0 8 , V 0 1 2 9 , N o 0 92 7 1 X ：和其他不显著项x 。、X ，、X 。分别进行分析比较，作 出如图5 - - - 7 所示的响应曲面图和等值线图，可以直观地 看到各因素之间的交互情况。X ：与X ，、X 。两项的等值 线图最圆，说明它们之间相互作用对水解度的影响最 小，而等值线图越扁平，表示因素之间的相互影响越 大：图中X 。、X ：两因素之间的影响最大。 1 2 6 _ 扣 9 6 O o 9 O 6 0 1 3 谢0 - - 0 3 - 0 6 - 0 9 X I 固定水平：X 3 = 0 ，X 4 = O 。 图5 底物浓度和加酶量交互作用的响应面和等值线图 F i g 5R e s p o n s es u r f a c ea n dc o n t o u ro fi n t e r a c t i o ne f f e c to f s u b a s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n de n z y m ed o s a g eo nD H 1 2 6 _ ， 9 6 0 0 9 O 6 O 3 湄_ o 0 3 - 0 6 - 0 9 _ E _ Y t 1 0 81 21 2 1 0 8 - 0 9 吨30 0 3 0 6 0 9 固定水平：X 。= O ，X 。= O 。 图6 底物浓度和温度交互作用的响应面和等值线圈 F i g 6R e s p o n s es u r f a c ea n dc o n t o u ro fi n t e r a c t i o ne f f e c to f s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nD H 1 2 6 墨 9 6 O 0 9 O 6 0 3 泛0 - 0 3 - 0 6 - 0 9 固定水平lX t = O ，X 3 = O 困7 底物浓度和p H 值交互作用的响应面和等值线圈 F i g 7R e s p o n s es u r f a c ea n dc o n t o u ro fi n t e r a c t i o ne f f e c to f s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dp Hv a l u eO nD H 2 5 3 林蛙油酶解工艺的优化参数组合 通过S A S 8 1 软件分析，模拟得出D H 最高的优化组 合为X 1 = o 、X 2 = 一0 5 、X 3 = o 、) ( 4 = o ，即加酶量为1 0 0 0 U g 、底物浓度0 7 5 、温度6 0 、p H 6 5 。分别以加酶 量、底物浓度、温度、P H 值最优组合为基准，时间 ( t ) 为自变量，D H 为因变量，确定其最佳酶解时间如图 8 所示。从图8 可以看出，在2 7 0 r a i n 时的水解度最高， 达1 3 4 ，与1 8 0 r a i n 时的水解度只相差0 6 。从经济 性角度出发，考虑到规模生产的能耗问题，将底物浓度 提高到中心点1 O ，酶解时间定在3 h 较为合适。因此， 木瓜蛋白酶酶解林蛙油的优化工艺参数为：加酶量为 1 0 0 0 U g 、底物浓度1 o o 、酶解温度6 0 0 、p H 6 5 0 ， 时间3 h 。在此条件下，底物水解度达到1 2 8 。 3 06 0 9 01 2 0 1 5 01 8 02 1 02 4 02 7 0 3 0 0 酶解时问( r a i n ) 图8 不同时间对水解度的影响 F i g 8 E f f e c t so fd i f f e r e n tt i m eo nD H 6 4 2 O 8 6 4 2 O 万方数据 27 2 2 0 0 8 V b l 2 9 N o 0 9 食品科孛工艺技术 2 6M A L D I T O FM S 分析结果 酶解产物经S e p h a d e xG - 1 5 ( 分离范围1 0 0 1 5 0 0 D ) 凝 胶柱进行初步分离，进一步采用基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱仪( M A L D I T O FM s ) 分析，测定分子量的大 小，结果如图9 所示。图中个别峰标注的数字表示每种 物质的分子量，分别为7 1 2 4 、8 2 6 6 、1 1 0 1 2 和1 3 2 6 1 D ， 对应的峰高表示该物质相应的含量。 舶0 0 加 6 唧 聱彻5 0 0 0 姗 1 0 0 D O 03 0 0 6 0 0 9 0 01 2 0 0l ，l 鲫2 1 0 03 4 0 02 7 毗 图9酶解物的I I A L D I - T O F1 4 S 图 F i g 9 M A L D I T O FM Sg r a p ho fe n z y m i ch y d r o l y s a t e s 3 讨论 传统的数理统计方法往往采用正交设计或均匀设 计，可同时考虑几种因素，寻求最佳因素水平组合， 但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的 一个明确的函数表达式，即多项式回归方程，从而无 法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。 响应面分析方法是通过中心组合实验研究几种试验因素 间交互作用的一种回归分析方法，具有实验次数少、周 期短，求得的回归方程精度高等优点，并从图形方面 分析寻求最优试验考察因素值。 本研究通过响应面分析法对林蛙油酶解工艺进行了 优化，并模拟得到多项式回归方程。结果表明，各因 素与指标之间的关系是简单的线性关系，而不是二次关 系，其中底物浓度对水解度的影响显著，而酶解温度、 时间影响不显著。结合考虑实际操作的方便性及试验方 差结果，确定了木瓜蛋白酶酶解林蛙油的最佳工艺条件 为加酶量1 0 0 0 U g 、底物浓度1 o o 、酶解温度6 0 0 、 p H 6 5 0 、时间3 h ，水解度达到1 2 8 ，比传统的正交 分析法提高了2 3 。酶解产物利用S e p h a d e xG 1 5 凝胶 柱初步分离，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 分析，确定了获得的四种物质的分子量，分别为7 1 2 4 、 8 2 6 6 、1 1 0 1 2 和1 3 2 6 1 D ，说明水解液中存在小分子肽 类物质。 参考文献： 【1 】 胡鑫