基因的重组与转移 (2).ppt

,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第六章基因的重组与转移,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,第一节DNA片段的体外连接,1.两段DNA的连接,依靠粘性末端,2.DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,ligase,nick,二、齐平末端（bluntend）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。,（1）同聚加尾法,2.人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接,linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCCCCTTAAGG,EcoRIlinker：,linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylinker:,优点：,（3）DNA接头(adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3GGCC-p5,BamHIadapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。,adapter的作用,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-OH3HO-GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5p-GATCCCGG-GGCC-,-CCGG-GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG-GGCC-,CCGGGGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P,P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！,5GATCCCGG-OHHO-GGCC5,5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-OH3HO-GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5GATCCCGG-HO-GGCC,CCGG-OH-GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamHI位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2.与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,TaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,TaqDNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2.DNA插入的方向正确,（1）用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTCT,重组,但移码突变！,4.防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,1.载体自身环化连接（能存活）,2.载体之间互相连接（能存活）,3.插入片段互相连接（不能存活）,4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）,17,1.目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,第二节重组体导入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2.菌种,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3.制备原理,4.制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,Onice5-10min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,Onice30min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（2）转染（transfection),大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。,1.外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3.转化方法,2.转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heatshock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,10ng载体DNA,100L感受态菌,Onice混合，静置10分钟,42C1分钟,加入1mLLB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,Onice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,4.平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,环形重组质粒质粒自我连接,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,环形质粒数,（1）重组质粒,5.影响转化率的因素,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞（competentcells),把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,6.体外包装的噬菌体的转导,（1）体外包装（invitropackaging）,（2）转导（transduction）,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。,（3）cI857基因突变的噬菌体,但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。,cI857,其它基因,溶源状态（DNA不转录、不翻译）,DNA,阻遏蛋白,阻遏蛋白,4445,DNA转录、翻译合成外壳蛋白,32,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（4）互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。,噬菌体2,(5)体外包装过程,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。,（6）转导,转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。,第三节外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,1.菌株选择,如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31,（1）利用原生质球进行转化,2.酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,插入外源基因的酵母载体,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,酵母,0.1mol/LLiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40%PEG4000,（2）利用Li+盐进行转化,叶盘,消毒,切取,土壤农杆菌浸泡,看护培养基,愈伤组织,分化幼苗,二、导入植物细胞,1.叶盘法（leafdisk),植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV,3-25F电击,愈伤组织,幼苗,分化,2.电击法（electroporation),又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles),DNA,1.2m钨弹头,吸附,特制手枪,射击植物,装入,3.基因枪法（genegun）,4.脓杆菌（agrobacterium）介导,农杆菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti质粒Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可以转移进入植物基因组.,TumorinducedbyA.tumefaciens,农杆菌（agrobacterium）,A、Ti质粒介导的整合转化程序,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。,（1）Ti质粒的结构与功能,TiPlasmid,T-DNAregion,Leftborder,Rightborder,virgenes,ori,已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。,auxin,Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156106D,约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine),Ti质粒的遗传特性及类型,a、Ti质粒的图谱,整个质粒160-240kb,其中T-DNA12-24kb,tms的编码产物负责：,合成吲哚乙酸,tmr的编码产物负责：,合成植物分裂素,tmt的编码产物负责：,合成氨基酸衍生物,冠瘿碱,b、Ti质粒致瘤的分子机制,损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。,c、T-DNA的染色体整合机制,T-DNA的染色体整合机制,d、Ti质粒的改造,除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；,除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；,安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；,安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；,安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。,除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；,共整合转化程序,二元整合转化程序,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；,重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；,以上述重组农杆菌感染植物细胞。,binaryTivectorsystem,B农杆菌介导的遗传转化：转化方法研究及宿主范围的拓展;转化机制研究;大片段的DNA转移;植株原位转化（inplantatransformation).,转化方法研究及宿主范围的拓展农杆菌有严格的宿主范围，它比较易浸染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。但近年来有一定进展，农杆菌在一定条件下同样可以感染单子叶植物。利用农杆菌介导分别从水稻、小麦、玉米、甘蔗等获得了转基因植株。下面几个因素使农杆菌介导转化单子叶植物获得进展：使用酚类物质诱导vir基因表达。首先发现AS（乙酰丁香酮）和HO-AS能诱导vir基因表达，后来发现邻苯二酚40多类酚类物质对virG有诱导活性。多种酚类复合物比单一酚类物质的诱导活性更高。此外，较低的pH、低于280C的温度、较高的渗透压、一些糖类等均能诱导vir基因表达。,转化方法研究及宿主范围的拓展,广寄主范围农杆菌菌株的筛选。主要是在农杆菌菌株的筛选、质粒载体的构建及菌株与载体的互作等方面进行了大量工作。使用单子叶植物特异启动子（如Actin,Ubiquione,and-Amylase的启动子代替35S启动子）和利用分生组织与农杆菌共培养。目前已清楚决定农杆菌与玉米的亲和性的是农杆菌的virA基因，对该基因进行改造可望提高农杆菌对单子叶植物的亲和性。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织被认为是获得单子叶植物转化成功的关键因素之一。,转化机制研究,T-DNA整合进植物基因组的机制比较复杂，对其进行研究有助于建立转基因新方法。插入T-DNA区的基因本身与T-DNA的转移无关，仅两侧的25bp同向重复序列是必须的,而且右边界更重要。其中14bp是保守的。整合进植物基因组的T-DNA会有一定程度的缺失、重复、填充和超界发生，甚至有整个质粒整合进基因组的报道。T-DNA转移主要与vir区各基因的协调作用有关。,大片段DNA的转移,通常转移的基因都是一个或几个功能基因，片段比较小（30kb)。可是，植物的一些性状，如抗病、抗虫、抗逆境、高产优质等均为数量性状，或者相关的基因往往成簇排列。这些性状的改造需要一个能将大片段DNA转入植物细胞并稳定表达的体系。最近构建了一种新型载体，它具有细菌人工染色体（BACs)和农杆菌双元载体的特点，能转移大片段DNA。即BiBAC载体，目前在主要农作物的改良中应用还比较困难，但在水稻中可以有效应用。,功能基因组的研究要求创造很多突变体，需要寻求简单的转基因方法。主要在拟南芥中应用，大量的植株抽真空20分钟，使细菌进入植物细胞间隙，或者将花朵抽真空让细菌进入，这种方法避免了细胞培养过程，但转化效率不高。,植株原位转化（inplantatransformation),SAAT:sonication-assistedAgrobacterium-mediatedtransformationTransgenicResearch6,329-336.,超声波生物作用机制：超声波的概念：频率高于人类听觉上限频率(约20000赫)的声波，称为超声波，或称超声。利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞，直接转化细胞，包括有细胞壁的植物细胞。利用超声波给植物转化受体创造大量的，分布均匀的微小创口，提高农杆菌侵染效率。,Fig.3.Crosssectionofcontrol(A)andSAAT-treated(BandC)immaturesoybeancotyledons.Bacteriaareindicatedbythearrows.TheepidermalcellsofthenonSAAT-treatedtissues(A)arestructurallyintactandbacteriacanbeseenonthesur