选3-1-1DNA重组技术的工具.ppt

,设想一,能否培育出具有抗虫性状的抗虫棉？,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低，成本高。而微生物生长迅速，容易控制。,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素等珍贵药物？,这些设想能实现吗？,经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术,基因工程,生物选修3,专题1基因工程,基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术或基因拼接技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,提取,普通棉花（无抗虫特性）,与运载体DNA拼接，导入,棉花细胞（含抗虫基因）,棉花植株（有抗虫特性）,表达,小结:,切割、改造、修饰、拼接、导入、表达,实现这一精确操作需要哪些工具？,生物选修3,莆田市第十五中学生物组王敏华,1.1DNA重组技术的基本工具,专题1基因工程,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,1、噬菌体侵染细菌实验的结果如何？,噬菌体侵染细菌,结果：,细菌的DNA被破坏，细菌裂解死亡,2、现存的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而绝灭，仍能保持相对稳定的状态呢？,3、单细胞生物如何抵抗入侵的外源DNA，保护自身？,4、怎样才能让DNA失效？,生物体都有各自的保护机制如动物的免疫系统，植物的保护组织,只有让外来的DNA失效,DNA酶,5、DNA酶的作用及其结果如何？,水解DNA，使DNA失效,6、DNA酶会使生物自身的DNA失效吗？,会,7、到哪里寻找这种能使外源DNA失效又不破坏自身DNA的酶？,到单细胞的生物中去找,8、为什么在单细胞中能寻找到这种能使外源DNA失效又不破坏自身DNA的酶？,单细胞生物比多细胞生物更容易受到外源DNA的侵入。在长期的进化过程中，使其必须有处理外源DNA的酶。,9、这到底是一种怎样的酶？,限制性核酸内切酶,“分子手术刀”,1、限制性核酸内切酶,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,主要是原核生物,4000种,（1）来源：,（2）化学本质：,（3）作用特点：,脱氧核苷酸的结构,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,EcoRI限制酶的作用,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,1、两种不同生物的DNA，用同种限制酶切割，那么会出现什么现象呢？,出现相同的黏性末端,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,GCTTAA,AATTCG,GCTTAA,AATTCG,EcoRI切割位点,黏性末端,黏性末端,思考与讨论,2、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？3、限制性核酸内切酶的作用特点体现了酶的哪种特性？,思考与讨论,限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并且只能在特定部位切割，这说明了酶具有专一性。,两个,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,TGACTTAA,AATTCCGG,TGACTTAA,AATTCCGG,不同生物的DNA片段会不会结合呢？,这两个缺口如何“缝合”呢？,“分子缝合针”,2、DNA连接酶,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,磷酸二酯键,DNA连接酶,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA,DNA聚合酶,具有连接单链DNA的本领,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,大肠杆菌,T4噬菌体,E.coliDNA连接酶:,T4DNA连接酶:,来源：,作用：,只连接互补的黏性末端,来源：,作用：,对于两种末端都能连接，但对平末端的连接效率较低,DNA连接酶的种类,单纯的DNA片段是很难导入受体细胞的，所以切割下来的目的基因导入受体细胞就需要有一个“分子运输车”帮助。,“分子运输车”,3、基因进入受体细胞的载体,那么这个运输车应该具备什么样的特点呢？,载体的必要条件,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作,载体的作用及种类,质粒,噬菌体的衍生物,动植物病毒,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,作用：,种类：,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,最常用运载体质粒,实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过