分子免疫学期末试题整理.pdf

分子免疫学 1、 免疫组学的概念；举例说明综合利用免疫组学技术发现新免疫分子的技术路线。 概念：概念：利用组学技术研究免疫系统的全套分子库、它们的作用靶分子及其功能。现代免 疫组学强调在基因组学和蛋白质组学研究的基础上，充分利用生物信息学、生物芯片、 系统生物学、结构生物学、高通量筛选等技术，大规模开展免疫系统和免疫应答分子机 理研究，发现新的免疫分子，为全面系统了解免疫系统和免疫应答提供基础。 举例：举例：反向生物学策略功能基因组的研究由传统生物学策略（生物活性蛋白质基因 细胞动物模型人体内功能及疾病关联）转换为反向生物学策略（DNA 蛋白质 细胞动物模型人体内功能及与疾病关联或者疾病标本DNA致病基因或易感基因 分析蛋白质细胞动物模型人体内功能及与疾病关联）所以新的免疫分子技术路 线可以归纳为： 免疫分子序列同源性分析和基因 Cluster 分析：利用免疫分子序列同源性分析方法， 寻找已知免疫分子同源序列，可以在 DNA、蛋白质 EST 序列以及已知序列基序间进 行比对来发现新的免疫分子。 像 Rosen 等利用 EST 数据库克隆出与 IL-10 同源的 cDNA 序列，从中发现了 IL-19. 免疫细胞基因和蛋白表达谱分析 免疫相关疾病的易感基因或致病基因分析，如高频性耳聋致病基因，遗传性乳光牙 本质致病基因的发现。 免疫细胞蛋白相互作用组（interactome）分析 利用免疫细胞筛选模型，开展基因表达文库或 RNAi 文库的功能筛选，如 ELK1 信号 通路筛选平台，发现与 MAPK 及 JNK 通路相关基因。 2、 列举 5 种免疫组学技术及其用途 基因芯片技术：利用这类固有寡核苷酸、基因组 DNA 或 cDNA 等的芯片与标记 的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分 析。 SEREX 技术，是以机体肿瘤细胞的免疫反应为基础，用肿瘤病人的血清对肿瘤 来源的cDNA表达文库进行免疫筛选， 以识别能与高低度IgG抗体反映的分子， 可用于鉴定多种类型肿瘤抗原。 外显子捕获技术：用于确定基因组 DNA 表达区域的一项技术。将拟检测基因 组序列克隆在特异性表达载体所含两个外显子之间的一个内含子中进行表达。 如果该基因组片段中包含一个外显子，表达产生的信使核糖核酸（mRNA）长 短会发生变化，能够被检测出来，可用于发现基因变异与疾病关联性。 噬菌体表面展示技术：将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白 结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白 随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体的生物技术。可用于开展抗感染免疫的研 究和疫苗及诊断试剂的开发。 细胞芯片技术：可以为功能基因组研究提供逐个基因研究的高通量平台，一个 芯片能够检测几百个基因，也可用于分泌蛋白质和酶学检测方面，具有大批、 微量、灵敏、自动、快速、可靠的特点。 3、 简述膜补体调节蛋白（CD35,CD55,CD46,CD59）的结构特点及活性，解释其对细胞的双 重作用（正常细胞和肿瘤细胞） CD35：单链穿膜糖蛋白 CR1 配体：C3b/C4b（高亲和力） iC3b/C3d（低亲和力） 主要存在于红细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞、B 细胞、部分 T 细胞、K 细胞、肾小球囊 细胞等 抑制补体活化：CR1 与 C3b 或 C4b 结合后，可促使 C3 转化酶（C3bBb 或 C4b2b）降 解，还可促进 I 因子对 C3b 和 C4b 的裂解作用，起到类似于 H 因子的作用。 清除免疫复合物： 带有 C3b 的免疫复合物与红细胞的 CR1 结合后， 可随血流到肝脏， 在那里被清除，或者促进吞噬细胞对免疫复合物的吞噬作用。在系统性红斑狼疮病 人， 可出现红细胞表面先天性和后天性的 CR1 数量减少， 与其发病有密切关系。 50 1400 个 CR1/红细胞 免疫调节 ：CR1 在 B 细胞发育的早期阶段即出现，大约 15-50%前 B 细胞，64-80% 的未成熟 B 细胞和几乎所有成熟 B 细胞都有 CR1，浆细胞无 CR1。CR1 对 B 细胞的 分化可能有促进作用。基因敲除实验证明，CR1 基因缺陷小鼠表现为 B 细胞对 TD 抗 原反应低下，证明 CR1 对于 B 细胞功能具有重要作用。 调理作用 ：中性粒细胞和单核-巨噬细胞上的 CR1，可与结合在细菌或病毒上的 C3b 结合，促进吞噬细胞的吞噬作用 CD55:促衰变因子 DAF ,单链糖蛋白，经糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜上， 配体：C3b,C4b， 分布于机体大部分细胞，也有可溶性表达（sDAF) 促进 C3 和 C5 转化酶衰变，抑制补体的活化，保护宿主细胞免遭补体介导的溶解破坏。 CD46 Membrane Cofactor Protein, MCP:单链穿膜糖蛋白，也通过 GPI 锚固定于细胞膜上 配体：C3b, C4b。 分布于大部分细胞，但红细胞缺如。抑制补体的活化。 I 因子的辅助因子，促进 C3b,C4b 灭活，抑制补体活化比 H 因子强 50 倍，保护宿主细胞免遭 补体介导的溶解破坏。 CD59 homologous restriction factor， HRF:同源性限制因子 ，单链穿膜糖蛋白，通过 GPI 锚 固定于细胞膜上 配体：C8 分布广泛，各种血细胞以及组织细胞 作用：抑制 C8 与 C9 的结合。 防止 MAC 对同种或自身细胞的溶解作用。 （种属限制性） 膜补体调节蛋白膜补体调节蛋白 mCRP 具有双重性具有双重性： 可以保护正常细胞免遭补体杀伤， 机体的正常细胞对自 身补体的攻击是有抵抗作用的，这种抵抗作用正是由于 CD55、CD35、CD46、CD59 等膜表 面的补体调节蛋白所发挥效应的结果。又促进肿瘤细胞的生长，CD35, CD55, CD46, CD59 在 某些肿瘤细胞的高表达，能够保护肿瘤细胞抵抗补体介导的杀伤，促进细胞生长 限制以抗肿瘤单抗为基础治疗的效应。 4、 简述 C1q，MBL, Ficolin, C3，C5, C9 的结构和功能特点。 C1q 为 18 条肽链组成的胶原蛋白样分子， 3 条肽链(A, B, C Chain）一组形成 6 个亚单位, 之 间由二硫键连接。 识别 IgG，IgM, HIV-1, CRP, 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS) C1r，C1s 均为单链血清蛋白酶。在钙镁离子参与下，一分子 C1q 与 2 分子 C1r 和 2 分子 C1s 形成复合 物，活化 C4 和 C2。 功能： “垃圾处理器” （1）清除凋亡细胞，维持细胞的稳态， （2）排除病原体，抗感染和抗 肿瘤， （3）免疫调节， （4） 参与炎症和自身免疫病(肾病、SLE、动脉硬化等） ， （5）C1q 与 衰老相关 MBL 为 18 条肽链组成的胶原蛋白样分子， 3 条肽链一组形成 1 个亚单位，6 个亚单位组成 6 聚体, 也有 三聚体、四 聚体和五聚体的形式 功能：MBL 直接结合病原菌，介导吞噬细胞的吸附、吞噬和杀伤。与 MASP1、2 结合激活补 体系统 Ficolin 为 12 条肽链组成的胶原蛋白样分子,3 条肽链一组形成 1 个亚单位, 4 个亚单位组成四 聚体.功能同 MBL C3 为 2 肽链结构，分别为 、 链， C3 处于补体三条激活途径的汇合点，起枢纽作用。 C3 为血清中含量最高的补体成分， C3 敲除小鼠表现易于感染、TD 抗原的免疫 ，应答缺陷， 参与调节糖脂代谢，细胞生长、分化、凋亡等 C5 为 2 肽链结构，分别为 、 链，C5 与 C5 转化酶中 C3b 结合，被裂解成 C5a 和 C5b。C5a 具有过敏毒素趋化作用等，C5b 参与攻膜复合体形成中性粒细胞激活、中性粒细胞黏附、迁 移和趋化，单核细胞激活，肥大细胞脱颗粒，肿瘤生长 C9, 穿孔素(Perforin) C9 和穿孔素结构类似，均为单链糖蛋白, N 端以亲水性氨基酸为主， C 端均以疏水性氨基酸为主。被活化后形成管状结构的多聚体，由 10 个以上的单体分子组 成，可通过其疏水性的 C 末端插入细胞膜，导致细胞溶解。 5、 Ig 基因重排过程及必要的条件 过程过程： B 细胞在发育过程中对 Ig 基因 V、 （D） 、J 基因片段重排。Ig 胚系基因中 V、D、J 片段的 两端为重组信号序列 （RSS） ： 即一个具有回文特征的 7 核苷酸序列与一个富含 A 的 9 核苷酸 序列， 加上两者之间的12或者23碱基对间隔序列。 V基因片段的下游为12bp间隔序列RSS， J 基因片段上游为 23bp 间隔序列 RSS。基因重排时遵守“12-23”原则：带有 12bp-RSS 的基因 片段只能与带有 23bp-RSS 的片段相结合，从而保证基因片段之间的正确重排和连接。 前 B 细胞按照上述原则通过“配件组合”的方式首先对 IGH 胚系基因进行重排。一个 D 和一个 J 片段通过 RSS 靠拢在一起，位于两者之间的 DNA 序列折叠成环状后被剪切，相邻 的 D 和 J 片段随之被 DNA 连接酶链接，形成 DJ 片段。随后一个 V 区片段以同样的方式与 DJ 链接，成为 VDJ 外显子与其下游的 J、IGHM 和 IGHD 共同被转录，所产生的 mRNA 以不同 的方式剪切后分别作为模板指导 Ig 和 Ig 的翻译与合成。IGH 基因成功重排之后 IGK 基因 开始重排。如果该 IGK 重排成功，B 细胞将表达 BCR 并进一步发育、分化成熟。否则，另一 条染色体的 IGk 基因将被活化并重排。如果不成功，Ig基因开始重排。如果 B 细胞所携带 的两套 Ig 轻链基因均不能成功重排，B 细胞将发生凋亡而被淘汰。 必要条件：必要条件： 重组信号序列（recombination signal sequences, RSS）:由七聚体、九聚体以及 两者间的间隔序列组成 ；在各基因片段两侧存在。 重组活化酶(recombinase)：由重组活化基因（RAG）编码；有 RAG-1 和 RAG-2 两种；RAG 出现于 B 细胞发育早期。 6、Ig 多样性产生的机制。 一、抗原诱导前（天然发生的） 1、V、D、J 基因重排造成的多样性 2、连接造成的多样性：即 V(D)J 重组时接头处的变化，出现 N 区和 P 核苷酸的插入 3、D 基因形成的多样性 二、抗原诱导的 V 区序列的改变 1、体细胞高突变(somatic hypermutation)： 成熟 B 细胞经抗原刺激后发生的序列高频率随 机突变，局限于 V 区，多发生于 CDR 区，其中 RGYW 基序是突变的一个规律；与 Ig 亲和 力成熟有关。 2、基因转换 ：指 IgV 区基因的核苷酸置换；主要是通过 IgV 区 5端的假基因 VL 和 VH 取代结构相似的重排后的V-J-L和V-D-J-H基因中的VL和VH基因， 有时也是插入或删除， 发生在单个 B 细胞发育早期，是抗体多样性产生的基因调节机理之一；可产生更高亲和 力的抗体。 3、受体编辑(receptor editing)：抗原受体的编辑：借 Ig 基因二次重排对 B 细胞抗原受体 进行修正，即清除对自身抗原应答或不适合的抗原受体的过程。二次重排可发生于 V-D-J 及其 5上游的其他 V 片段之间，和 V-D-J 与其 3下游的其他 J 片段之间，也可发生于轻链 V 基因，引起抗体多样性的发生。 三、Ig C 区序列的改变-类别转换 小鼠和人的重链恒定区的结构、细胞因子诱导类别转换 7、 试述肿瘤免疫治疗中细胞因子的作用。 细胞因子（cytokine）是应用最广泛、疗效最明确的一类生物反应调节剂。已知有可能 用于恶性肿瘤治疗的细胞因子包括白细胞介素、 干扰素、 肿瘤坏死因子及集落刺激因子。 主要通过调节免疫功能发挥抗肿瘤作用的细胞因子： IL-2:促进 T 细胞的增殖及 B 细胞的增殖和分化，诱导生成淋巴因子激活的杀伤细胞 （LAK） ，促进 NK 细胞增殖，加强 NK 细胞的杀伤能力。 IL-12：能够通过增强 NK 细胞和 LAK 细胞的细胞毒活性、促进 CTL 反应、诱导 NK 细 胞和 T 淋巴细胞分泌 IFN 发挥抗肿瘤作用。 IFN- ：主要由 NK 细胞和 T 淋巴细胞产生。是一种很强的免疫调节剂，他主要通过 调节机体的免疫功能来发挥作用。IFN 可促进 MHC I 类分子的表达， CD8+T 细胞 通过识别 MHC I 类分子-抗原肽复合体，杀伤肿瘤细胞，这种复合体与 IFN 接触后， 可增强肿瘤细胞对 CTL 杀伤的敏感性。此外，IFN 还可以增强 NK 细胞的活性。 主要通过直接抗肿瘤作用发挥功能的细胞因子： IL-4：由 T 辅助细胞分泌、主要对 T 细胞起作用的一类细胞因子。它可以促进淋巴细 胞的生长，刺激胸腺细胞增殖分化为 CTL。 IFN- 、 ： IFN 机体对病毒、 双链 RNA 及有丝分裂原进行反应而产生的一种蛋白质。 IFN- 、 主要通过抑制肿瘤细胞增殖和分化（组织细胞由 G0G1） ，促进部分恶 性细胞表型的逆转，发挥抗肿瘤作用。 TNF：对肿瘤有直接溶解作用，在体内引起肿瘤坏死，使肿瘤体积缩小甚至消失。另 外，TNF 还能增强 NK 细胞活性、刺激 T 细胞增殖。 8、 举（2 例）说明细胞因子在临床的成功应用。 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)免疫治疗是目前临床应用较为广泛且有效的肿瘤 免疫治疗手段之一。在体外诱导过程中，细胞因子对 CIK 的分化和功能起着决定作用。 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells， CIK) 是一群在体外经 IL-1 、 IL-2、 IFN- 及抗 CD3 单克隆抗体等诱导而成的以 CD3+、CD56+细胞为主的 CD4+和 CD8+ 效应 T 细胞群，兼具有 T 细胞强大的杀瘤活性以及 NK 细胞的非主要组织相容性复合 体(MHC) 限制性杀瘤的优点。与其他过继免疫治疗细胞相比，CIK 具有增殖速度快、杀 伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为 是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。CIK 可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。 CIK 对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导 致肿瘤细胞破裂;CIK 具有较强的细胞毒活性，可分泌 IL-2、 干扰素(IFN- )、肿瘤坏 死因子 (TNF- )和粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞因子进一 步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免 疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌 和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。 T H 2 细胞增多和释放 T H 2 类细胞因子是 型变态反应疾病发生的关键, 通过给予 T H 1 类细胞因子来恢复 T H 1 类细胞因子和 T H 2 类细胞因子之间的平衡 是变态反应疾病免疫治疗的途径之一, 研究表明 T H 1 类细胞因子可以降低 T H 2 细 胞的活性和促进 T H 1 的细胞功能。可用于变态反应疾病治疗的 T H 1 类细胞因子包 括 IL-12 、 IFN- 和 IFN- 。 通过雾化吸入 IFN- 治疗哮喘的研究, 为其它细胞因子 雾化吸入治疗哮喘起到了借鉴作用 。 9、 请结合本人专业举例说明趋化因子的功能和作用机制。 趋化因子是一种能够对白细胞趋化性的方向性迁移进行调节的小分子量分泌蛋白 , 主要由炎性组织产生 ,包括 CC 家族、 CXC 家族等。 近年来发现趋化因子不仅在炎性 组织表达 ,也在淋巴瘤组织中表达,可能参与了 cHL 浸润背景的形成和维持。 研究数据表明多种 CC 趋化因子家族的成员在 cHL 的 H/RS 细胞中高表达。 CCL17/ TARC 是 HL 的一个重要的预后指标 CCL17 /TARC 可与其受体 CCR4 结合 从而募集 Th2 型 T 细胞 ,还可能通过结合 CCR8 促进 CD4 + 、 CD25 +、Treg 细胞的募集。 CCL22/MDC 和 TARC 一样 , MDC 也结合 CC 趋化因子受体 4( CCR4)并且通过结 合 CCR4 表达 T 淋巴细胞和其它白细胞的趋化活性。CCL17 和 CCL22 能够募集 CCR4 阴性的 Treg 细胞 ,因此为肿瘤细胞逃脱免疫宿主监视提供了有利的微环 境。 CCL5/RANTES 是一种对单核细胞、 T 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞以及肥大细胞都 有趋化性的细胞因子,主要结合 CCR1、 CCR3 和 CCR5。HRS 细胞能够分泌功能 性 CCL5/RANTES,诱导肥大细胞的聚集。 此外 , CCL5 能够募集 CD4 + T 淋巴细 胞和嗜酸性粒细胞进入 HL 周围淋巴结组织 ,促进典型 HL 细胞微环境的形成。 CXC 类趋化因子是趋化因子大家族中的一个亚族 ,在肿瘤细胞的发生发展中 常伴随着一系列的分子生物学改变。CXCL12，又称基质细胞衍生因子或前 B 细 胞刺激因子，目前大部分学者认为 CXCR4 是是对其配体 CXCL12 具高度亲和力 和绝对特异性的唯一受体。CXCL12 及其受体 CXCR4 可通过自分泌、旁分泌及远 处分泌等多种作用方式影响淋巴肿瘤的进展和转移。 （目前认为肿瘤发生特异性器官转移可能涉及到以下步骤：肿瘤细胞克隆增殖, 在 其细胞表面表达 CXCR4;肿瘤细胞脱离原发肿瘤, 穿过肿瘤内淋巴管和管壁进入体循环; 肿瘤细胞在富含 SDF-1 器官的血管壁被捕获;CXCL12 与 CXCR4 的结合导致肿瘤细胞不 再被吸引到其他部位 , 从而发生局部增殖, 血管增生, 形成转移性肿瘤, 具体是在 CXCL12 激活细胞表面的各种黏附分子(如整合素), 并分泌更多的基质金属蛋白酶 (MMP)、N0、VEGF, 使表达 CXCR4 的肿瘤细胞穿过基底层等进入体循环, 转移到特定的 部位。 ） 10、 请设计实验证明某分子是新的白细胞分化抗原。 新型潜在膜分子进行筛选（无免疫相关功能报道，在免疫系统高表达，尤其是在特定免 疫细胞亚群中高表达分子，有限考虑一型或者二型糖蛋白） （1）对新发现膜分子的染色体进行定位分析，观察是否与其他 CD 分子定位同源或相似， 对分子类型和功能有提示作用。 （2）通过生物信息学来观察蛋白的表达谱，观察在不同组织、类型细胞中的表达的特点。 若在髓系来源的前体细胞和终末分化的免疫细胞中表达有很大差异， 比如在骨髓来源细胞中 表达较低，但经过诱导分化后 mRNA 和蛋白质显著上调，则提示该分子在白细胞分化中起 作用，可提示新的分子有 CD 分子的特点。 （3）证明新的分子为新的 CD 分子，首先要制备单克隆抗体，可用合成多肽、重组蛋白等 作为抗原，制备针对目的蛋白的单克隆抗体。可用制备的抗原免疫动物获得单克隆抗体。 （4）然后进行抗体的鉴定，可先用用 SDA-PAGE 和 westernblok 等方法观察抗体是否可以很 好识别过表达的目的蛋白，再应用 westernblot 等方法观察获得的抗体能否识别原代细胞的 内源性蛋白。 （5）可用免疫荧光等方法确定蛋白是否定位在细胞的细胞质膜上。 （6）为进一步确定抗体功能，可用抗体交联、免疫荧光等方法试验方法探究获得的抗体是 否具有功能。 观察抗体能否通过某些引号通路引起细胞内报告基因表达的改变。 同时还可进 行基因敲除和恢复试验进一步分析相关目的分子的功能。 （7）如果已让的鉴定都已合格，则可证明新的分子为一个新的 CD 分子。然后可进一步制 备多株单克隆抗体，再次鉴定抗体，能否识别原代细胞内源性蛋白。若可以对内源性蛋白很 好的识别，则可对获得的单克隆抗体进行保留，为以后获得 CD 编号做准备。 11、 结合本专业举例说明免疫细胞膜分子的结构、功能及可能的临床应用。 CD20 是一种 B 细胞分化抗原，是人类 B 淋巴细胞表面特有的标识，由 297 个氨基酸残基组 成，相对分子量约为 33*10，属于非糖基化磷蛋白，对 B 淋巴细胞的增殖和分化具有调节作 用。CD20 仅表达于前 B 淋巴细胞、未成熟 B 淋巴细胞、成熟 B 淋巴细胞，激活 B 淋巴细胞 中，在浆细胞、淋巴多能干细胞及其他组织中均无表达。超过 95%的淋巴细胞瘤都有 CD20 的表达，而且其容易与抗体结合，结合后不易脱落，因此 CD20 分子是治疗 B 淋巴细胞瘤的 理想靶抗原。抗 CD20 单抗通过补体依赖细胞毒作用（CDC）和抗体依赖细胞介导的细胞毒作 用（ADCC）诱导细胞内产生促凋亡信号。目前已有针对 CD20 抗原的抗体获准上市，用于 B 细胞来源的非霍基金淋巴瘤(NHL)的治疗。 12、 白介素的概念；举例说明不同白细胞介素家族成员的特点。 来自单核/巨噬细胞、淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起 作用的因子，统一命名为白细胞介素（interleukin，IL）目前已知许多 IL 是来自单核 /巨噬细胞和淋巴细胞之外的其他细胞。 白细胞介素的分类： IL-1 家族：是一组主要起免疫调节作用的激素样肽类物质, 即炎症前期细胞因子, 可由多种细胞合成和分泌,众多的生物学效应使得 IL-1 超家族在免疫系统中成为一 类起中心作用的细胞因子。 IL-2家族： 是I型细胞因子的重要家族之一， 共用 c受体链， 包括 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 和 IL-21。 IL-6 家族： 其特点是共用 gp130 （CD130） 受体亚单位； IL-6 家族细胞因子通过 gp130 受体介导 JAK-STAT3 通路，调节细胞增殖、存活、迁移、侵袭、血管生成和炎症。 IL-10 家族：IL-10 超家族一般由 170-210 个氨基酸残基组成，均由各自的前提加工 而来。这些分子在一级结构上具有一定的保守性，含有一个疏水氨基酸构成的一个 核心和两对链内二硫键，使得这些分子具有相似的空间构象，因而能够与 II 型细胞 因子受体结合。 包括 IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28A/B, IL-29. IL-12 家族:均由两个亚单位组成的异源二聚体，各亚单位具有结构同源性，包括 IL-12, IL-23, IL-27 和 IL-35。 IL-17 家族 IL-3（集落刺激因子） IL-8（趋化因子） 其他 IL 13、 举例说明发现新白细胞介素的技术。 以往白细胞介素的发现多是通过传统生物学策略，即生物活性蛋白质基因，这 样的路线；在当代，尤其是在人类基因组计划完成后，各实验室多采用反向生物学的策 略发现新的白细胞介素，即基因蛋白质生物学活性，这样的路线。 现以 CCDC134 这一新发现的可能成为编码新白细胞介素的基因为例，简单叙述其发 现的技术路线： 通过生物信息学技术发现新的未知功能的基因，具体有一下几个步骤: 白细胞介素分子序列同源性分析和基因 Cluster 分析； 差异显示技术克隆细胞因子，如 SSH 技术等 Blast 检索及 EST 分析和拼接 检测基因存在的真实性（从 mRNA 及蛋白质水平检测） ，运用免疫组化等方法检测 该基因在各种组织中的表达情况，证明其确实存在： 证实其表达产物为分泌蛋白：证明其氨基酸序列 N 端信号肽的存在并证明其确实 起作用(可用去除信号肽的截短体实验证明),还可用 BFA 封闭实验，证明其是否为经典 的分泌蛋白。 对其生物活性进行研究：可利用高通量的免疫细胞筛选模型等方法进行功能筛选 基因表达产物的亚细胞定位：如为核蛋白可用去除 NLS（核定位信号） ，看是否影 响其功能来证明。 基因表达产物与其他蛋白质之间的相互作用： 可用 GST pull-down、 免疫共沉淀、 ChIP-Seq 等技术。 证明其与免疫反应、炎症等相关的作用。 进一步研究其发挥相关作用的机制，以便找出与哪类白细胞介素相似。 14、 如何鉴定一个克隆的新基因是凋亡相关基因？解释所用的凋亡检测技术以及原理。 Caspase 家族发现、凋亡机制的研究获得重大突破 相关基因及调控、信号转导、分子机制 外源性：死亡配体、死亡受体、起始 Caspase8、效应 Caspase3、凋亡 内源性：DNA 损伤&TP53、线粒体/细胞色素 C、起始 Caspase9、效应 Caspase3、调亡 细胞凋亡的检测方法： 1) 形态学检测： 光学显微镜：a 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但发现发泡 现象， 细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、 变圆、 脱落。 b 染色细胞： 常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈 新月体状附在核膜周围， 凋亡晚期核膜裂解、 染色质分割成块状和凋亡小体等典型 的凋亡形态。 荧光显微镜、共聚焦显微镜：一般以细胞和染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的 进展情况。 电镜：结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，边缘化。细胞凋亡的晚期，细 胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 2) 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法） ：FCM 分析、荧光显微镜、共聚焦显微镜 磷脂酰氨基酸正常时位于细胞膜内侧，凋亡时从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴 露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和 力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-v 作为 荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡 的发生。 3) Csapase 活性的检测： Western Blot： Caspase 家族在介导细胞凋亡过程中起非常重要的作用。 其中 capase-3 为关键的执行分子，正常以酶原（32kd）形式存在于胞浆中，在凋亡的早期，被激 活，活性形式的 Caspase3 由两个大亚基（17kd）和两个小亚基（12kd）组成，裂解 相应的胞浆胞核底物（如 PARP、lamin 等） 荧光分光光度计分析：活化的 Caspase-3 能特异切割 D1E2V3D4-X 底物，水解 D4-X 肽 键。根据这一特点，设计出荧光物质或 p 硝酸酯（pNA）偶联的短肽 Ac-DEVD-AMC 或 Ac-DEVD-pNA。在共价偶联时，AMC 或 pNA 不能被激发荧光或显色，短肽被水 解后释放 AMC 或 pNA，自由的 AMC 或 pNA 才能被激发发射荧光或显色。根据释放 的 AMC 荧光强度大小以 pNA 显色的深度，可以测定 capase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被活化的程度。 Caspase3、8、9 活性分析 4) 线粒体功能的检测： 线粒体膜势能的检测 细胞内 ROS 的检测：氧化应激可影响线粒体膜通过性转运孔开放或关闭而起作用， 线粒体ROS产生增多可以引起线粒体PTP开放， PTP开放会引起线粒体膜电位下降， 线粒体肿胀和细胞色素 C 释放，继而引发细胞凋亡。 Western Blot ：BCL-2 家族蛋白检测 Bcl-2 家族蛋白种类：30 余种 1 抗凋亡蛋白：包括 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1、Boo 和 Ced-9 等 2 促凋亡蛋白：包括 Bax、Bak、Bcl-Xs、Bcl-rambo 等 3 BH3-only 促凋亡蛋白，包括 Bid、Bad、Bim、Bik/Nbk、Hrk/DP5、 BNIP3、EGL-1、Noxa、Bmf、PUMA/Bbc3 等 5) DNA 片段化检测：Tunel 实验 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记 细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3-OH 末端，可在 脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将 dUTP 和荧光素、过氧化物酶、碱 性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检 测。 6) 细胞周期的检测：FCM 分析亚二倍体细胞以及各周期变化 7) 其他：死亡受体（Fas，TNFR 等）凋亡抑制蛋白检测 信号转导通路中的蛋白磷酸化 或去磷酸化的检测（磷酸化抗体，如 p38，ERK 等的检测）细胞内 Ca 瘤的检测 TP53/P53 15、 如何鉴定一个新的自噬相关基因？简述检测方法以及原理。 构建某蛋白真核表达载体并转染细胞，经筛选并经 RT-PCR、Western Blot 进行鉴定，建 立某蛋白高表达的细胞株，进而研究某蛋白对诱导细胞自噬的影响 1) 形态学方法：电子显微镜检测自噬体和自噬溶酶体 2) 自噬的特异标志物检测： LC3-II 含量增多， LC3-II/LC3-I 比例的升高： western blot （自噬时， LC3-I 转变为 LC3-II） 内源性斑点状 LC3 增多：免疫荧光染色，免疫电镜 GFP-LC3 斑点增多，定量检测：荧光显微镜 a) 自噬流的检测：双荧光自噬指示体系 RFP-GRP-LC3（RFP 稳定表达，自噬溶酶体中 GRP 降低） b) 长寿命蛋白降解，同位素标记 c) 自噬抑制剂的应用：3-甲基腺嘌呤（3-MA） 氯喹 ATGsiRNA 的应用 16、 如何理解自噬在肿瘤发生发展中的作用？ Cancer：carcinoma sarcoma ovarian breast gastric 自噬在不同肿瘤或同一肿瘤的不同阶段发挥不同的作用。自噬对肿瘤的双重作用： 1)