分子克隆实验标准步骤.doc

分子克隆实验标准步骤一、 常规分子克隆实验流程：二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR扩增目的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例体系（50ul）：10KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate 50-200ngKOD 0.5ulddH2O up to 50ul程序： 95 2min 98 10s 58 30s 35cycle 68 2kb/min 68 7min 12 2. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.51TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。3. 试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500l平衡液BL，12,000rpm(13,400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100l，则加入100lPN溶液），60水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600l漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复操作步骤。将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(13,400g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(13,400g)离心2min收集DNA溶液。4. 酶切反应（编号Clone SOP-4）以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：10FastDigest buffer or 10FastDigest Green buffer 5ulFastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ulFastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ulDNA NddH2O up to 50ul酶切体系混合均匀后置于37条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。5. 酶切产物的回收（编号Clone SOP-5）以本实验室常用Axygen AxyPrep PCR Clean-Up Kit（Axygen）为例在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的Buffer PCR-A（若Buffer PCR-A不足100ul，加至100ul），混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000g离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加400ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，静置2min。在制备管中央加25-30ulEluent或ddH2O，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。6. 重组反应（编号Clone SOP-6）以本实验室常用NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒（Novoprotein）为例体系：10重组缓冲液 1ulNovoRec重组酶 0.5ul线性化载体 N插入片段 NddH2O upto10ul注：载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间进行重组反应混匀后在37水浴锅中放置20至30分钟后取出置于冰上立即进行转化7. 转化（编号Clone SOP-7）从-80冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰上缓慢解冻并分装。取出连接产物，加入到分装的感受态中，置于冰上孵育25min42热激90sec，置于冰上孵育2min，加入700ul，不含抗生素的LB培养基，180rpm37培养45min。3000rpm离心1min，弃去大部分上清液体，留下约50-100ul，重悬沉淀，滴在已经加入玻璃珠的LB平板（带有相应抗性）上，用玻璃珠涂抹均匀。倒出玻璃珠，LB平板置于37培养箱，过夜培养。8. 挑克隆摇菌与菌落PCR检测阳性克隆（编号Clone SOP-8）从37培养箱中取出过夜培养的平板，用镊子小心镊取高压灭菌后的枪头，以枪头的尖头轻触单个克隆，然后将枪头尖分别在装有有150ulLB液体（带有相应抗性）的1.5mlEP管和菌落PCR反应体系中搅动几下。将装有培养基的EP管37220rpm培养3小时。菌落PCR：20ul菌落PCR体系，以本实验室常用2TSINGKE Master Mix为例：2MIX 10ulPrimer 1 0.5ulPrimer 2 0.5ul菌ddH2O 9ul菌落PCR程序：95 3min95 30s58 30s 30cycle72 1-2kb/min72 5min12 琼脂糖电泳检测PCR产物以判定阳性克隆9. 菌液的扩大培养（编号Clone SOP-9）将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10ul接种至5ml LB（含抗性）培养基中，在220rpm，37摇床中过夜培养。10. 小提质粒（编号Clone SOP-10）取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取（天根质粒DNA小提试剂盒）。柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm(13,400g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4500rpm离心5分钟，尽量吸除上清，将菌体沉淀收集到一个离心管中。向留有菌体沉淀的离心管中加入200l溶液P1（事先已加入RnaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入200l溶液P2，温和地上下翻转68次使菌体充分裂解。向离心管中加入300l溶液P3，立即温和地上下翻转68次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(13,400g)离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色可再次离心后取上清。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW（事先已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW，12,000rpm(13,400g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400g)离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80l洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm(13,400g)离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。置于4备用。三、 实验过程注意事项1. PCR实验请注意酶的扩增效率，有的酶是1kb/min，有的是2kb/min，具体请查看相应酶的说明书。2. 琼脂糖凝胶制备过程中请注意污染区与非污染区，在电泳点样前请确保样品和DNA Marker已加入核酸染料。3. 试剂盒使用之前检查漂洗液是否已加入无水乙醇。四、 常用培养基与缓冲液的配制：1. LB液体培养基（1L）配方：10g 胰化蛋白胨(Tryptone) 5g 酵母提取物(Yeast extract) 5g NaCl用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。2. LB液体培养基（1L）配方：10g 胰化蛋白胨(Tryptone) 5g 酵母提取物(Yeast extract) 5g NaCl15g琼脂粉用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。3. TB液体培养基（1L）配方：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨 12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK