微生物学实验三 细菌芽孢染色.doc

实验三 细菌芽孢染色13生物基地 201300140059 刘洋 2014-10-16同组者：吕赞 刘沛余 马华峥一、 实验器材1. 菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski）12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物2. 溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液3. 仪器和其他用品酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹，滴管，无菌水等二、 实验目的1. 学习并掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征。2. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。三、 实验原理简单染色法适用于一半的微生物菌体染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如芽孢、荚膜和鞭毛，对他们进行观察前需要进行有针对性的染色。芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石炭酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。四、 实验步骤芽孢染色（Schaerffer-Fulton氏染色法）1. 制片按常规方法涂片、干燥及固定2. 加热染色向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3. 脱色待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。4. 复染用0.5%番红水溶液复染2min。5. 水洗用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。6. 镜检将载玻片晾干后油镜镜检。五、 注意事项1. 选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂。2. 加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。3. 脱色必须等待玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。六、 实验结果及分析番红被洗掉的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌菌体不明显的梭状芽胞杆菌梭状芽胞杆菌七、 结果分析 菌体均被染成绿色的原因可能是番红复染时间较短或者冲洗过度导致复染不完全。枯草芽孢杆菌主要为中生芽孢，梭状芽孢杆菌主要为端生芽孢且膨大。八、 思考题1. 为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽胞？在加热条件下，芽孢壁的通透性会发生变化，使得染液容易进入芽孢完成染色，用简单染色法不能使芽孢染色，因此不能观察到细菌芽胞。2. 若你在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。（1）所选用菌种菌龄较老，芽孢囊已经破裂。（2）加热染色时温度过高，使得菌体和芽孢囊破裂。（3）细菌培养环境较为恶劣，大部分营养体已转变