愈创木酚比色法测定过氧化氢酶活性.doc

过氧化物酶活性的测定（愈创木酚比色法）原理过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。仪器药品721型分光光度计离心机秒表 天平研钵 磁力搅拌器愈创木酚 30%过氧化氢20mmol/L KH2PO4100mmol/L 磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19l，混合均匀，保存于冰箱中。操作步骤1称取植物材料1g，加20mmol/L KH2PO45ml，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，贮于冷处备用。2取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。3以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/minmg蛋白质（或鲜重g）表示实验三十八 过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 一、仪器、药品与材料 （一）实验材料 新鲜植物组织。 （二）仪器与用品 分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。（三）试剂 愈创木酚。 30过氧化氢。 100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0 （见附录7）。 反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 L，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 L，混合均匀，保存于冰箱中备用。 二、实验步骤 1称取植物材料 0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以 4000 rpm 低温离心 15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。 2取2支试管，于1只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。 3结果计算：以每分钟OD变化值（A470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。 过氧化物酶活性（U/gFWmin）= A470VT/WVS0.01t 式中： A470反应时间内OD变化值。 VT 提取酶液总体积（mL）。 W 植物鲜重（g）。 Vs 测定时取用酶液体积（mL）。 t 反应时间（min）。 三、思考题 测定过氧化物酶活性除了本方法外，还可以采用什么方法进行？