广州市宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立及其耐药谱型和基因型关系研究

偶序号： 编码： “挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛决赛作品申报书 作品名称：广州市宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立及其耐药谱型和基因型关系研究 学院名称： 兽医学院 申报者姓名 （集体名称）： 卢 佳 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。A1申报者情况（个人项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写 个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）； 2本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。姓 名卢 佳性别女出生年月1986年10月申报者情况学院全称兽医学院专 业动物医学现学历本科年级05级学制 5 年入学时间2005年9月作品全称广州市宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立及其耐药谱型和基因型关系研究毕业论文题目通讯地址华南农业大学华山宿舍8栋419房邮政编码510642单位电住地通讯地址华南农业大学华山宿舍8栋419房邮政编码510642住宅电作者情况姓 名性别年龄学历所在单位蒿子峰男22本科华南农业大学兽医学院梁肖霞女22本科华南农业大学兽医学院资 格 认定学院学籍管理部门意见 是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校中国学生（含专科生、本科生和研究生）。是 否若是，其学号为：200530330517 （部门盖章） 年 月 日院系负责人或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果 是 否 负责人签名： 年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（D） A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路广泛而持续的抗生素压力下，细菌除了改变血清型、毒力引子和系统发生背景来逃避抗生素和机体免疫系统的清除外，细菌还能通过改变生存模式（生物被膜的形成）得以继续生存。成熟的BBF中的细菌可以耐受10002000倍于浮游菌MIC的浓度。这表明BBF形成后具有强大的耐药屏蔽作用。相关研究报道细菌生物被膜的形成与抗生素的持续使用有关，是抗生素压力环境下细菌得以生存的方式。细菌生物被膜的形成过程中许多成分可作为药物传递系统的靶标。因此，如提高药物对BBF的渗透性，降低细菌的黏附性以阻断被膜形成的第一步。本研究主要通过抗生素压力下大肠杆菌生物被膜体外模型的建立，阐明在模拟的抗生素环境下大肠杆菌的生物被膜耐药机理研究，对保证宠物的健康具有重要的社会意义，同时为兽医临床合理应用抗生素提供理论依据。 作品的科学性、先进性及独特之处1. 首次在国内对宠物源性大肠杆菌进行生物被膜的分析，并研究其与耐药谱型和基因型之间的关系进行分析研究，具有创新意义。2. 对广州市不同宠物医院的患病宠物进行细菌分离鉴定，具有较强的地方色彩，为广州市宠物业的健康发展提供科学指导。作品的实际应用价值和现实意义广泛持续的抗生素压力下一些重要的人畜共患病病原发生变异并导致疾病多样性，多种抗生素的滥用，导致细菌在抗生素压力下形成生物被膜以适应生存的需要。生物被膜的形成，不仅使细菌在耐药的过程中发挥屏蔽作用，而且与其它耐药机理相互影响。本研究旨在通过抗生素压力下大肠杆菌生物被膜体外模型的建立，阐明在模拟的抗生素环境下大肠杆菌的生物被膜耐药机理研究，对保证宠物的健康具有重要的社会意义，同时为兽医临床合理应用抗生素提供理论依据。研究细菌生物被膜和耐药性的关系，不仅有助于了解耐药性的发生机理，而且对实际生活中避免和解决由细菌生物被膜引起的相关疾病的治疗也有一定的指导意义。 学术论文文摘采用微量肉汤稀释法对120株大肠杆菌进行宠物医院常用15种抗菌药物的MIC(最小抑菌浓度)的研究，分析其耐药谱型；同时对生物被膜进行改良结晶紫染色进行半定量研究，利用快速银染和扫描电镜进行定性研究；用分子生物学方法对大肠杆菌的基因进行筛选，研究基因谱型和耐药谱型与生物被膜表型之间的关系，初步分析耐药谱型和基因型与生物被膜表型之间的关系，以此筛选出生物被膜耐药相关基因。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励2008年在广州举办的中国畜牧兽医学会2008年学术年会第一届中国兽医临床大会上，论文120株宠物源性大肠杆菌耐药性调查分析研究被论文集收录。鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录参考文献1Stepanovic, S., Cirkovic, I., Ranin, L., Svabic-Vlahovic, M., 2004. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Lett. Appl. Microbiol. 38, 428432.2 屈常林,等.细菌生物被膜与抗生素耐药机制研究发展J.动物医学发展,2008,29(3):86-90.3Passaricllo C，Berlutti F，Selan L，et al.A rapid staining procedure to demonstrate glycocalyc production and bacterial biofilmsJ.Microbi-olgIolgica,1994,17:225.4David G. Davies, Matthew R.,et al.The involvement of Cell-to-Cell Signals in the Development of a Bacterial Biofilm.SCIENCE.,1998,4,105 陆东明,等.结晶紫染色法检测活体细菌的试验研究J.青海医学院学报,2008,29(4).6金玉珍,等.Holzer改良磷钼酸结晶紫染色法J.黑龙江医药科学,1994,(5):17李乃静,等.银染法鉴定细菌生物被膜J.辽宁药物与临床,2003, 6（1）：37-38.8何平,等.银染法鉴定克雷伯杆菌生物被膜J.中国实用内科杂志, 2002，22（2）:84-85 9孔晋亮，刘晓岚，陈一强，王立赞，闫萍，温红侠，银染法观察铜绿假单胞菌生物被膜变化初探 济宁医学院学报 2007,3(30 )1 : 27-2910张军,等.PCR技术操作的影响因素及注意事项J.现代畜牧兽医,2008,(4)申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）广州市宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立及其耐药谱型和基因型关系研究 论文一篇科研管理部门签章 年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。目前国内外多采用分子生物学手段，对生物被膜进行基因水平的研究，通过基因敲除等手段，比较敲除前后细菌形成生物被膜的生理生化状态的改变。同时借助于报告基因如绿色荧光蛋白（GFP）进行标记，通过激光共聚焦显微镜等观测手段对生物被膜的行程进行实时监控，观测在生物被膜的形成过程中，细菌生物被膜的动态变化过程。此外，随着对生物被膜研究的深入，越来越多的学者开始关注生物被膜的形成与耐药谱型和基因型之间的关系研究，通过比较不同来源菌株的耐药谱型和基因型，来阐述生物被膜导致的耐药机理。因此，研究在生物被膜形成的不同阶段，相关基因相互作用的机理及其之间的联系，对阐明生物被膜的形成和发展变化具有重大的理论和实际意义。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名性别年龄职称工作单位通讯地址邮政编码单位电话住宅电话推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价其它说明E参赛作品打印处广州市宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立及其耐药谱型和基因型关系研究作者：卢佳 梁肖霞 蒿子枫 陈伟清指导老师：刘雅红（华南农业大学兽医学院，广州，510642）摘 要：采用微量肉汤稀释法对120株大肠杆菌进行宠物医院常用15种抗菌药物的MIC(最小抑菌浓度)的研究，分析其耐药谱型；同时对生物被膜进行改良结晶紫染色进行半定量研究，利用快速银染和扫描电镜进行定性研究；用分子生物学方法对大肠杆菌的基因进行筛选，研究基因谱型和耐药谱型与生物被膜表型之间的关系，初步分析耐药谱型和基因型与生物被膜表型之间的关系，以此筛选出生物被膜耐药相关基因。关键词：大肠杆菌 生物被膜 基因型 耐药谱型1 前言细菌生物被膜（Bacterial Biofilm , BF) 是近10 年来逐渐受到重视的一种细菌生物学特性。而且，有关细菌生物被膜的报道主要是医学临床中各种体内插管（如导尿管、大静脉导管,气管插管等）的表面而导致导管相关感染(catheter related infection)。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式, 由细菌（包括浮游细菌和生物被膜菌）和自身分泌的各种胞外基质共同组成。细菌生物被膜（Bacterial Biofilm , BF) 是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体,BF 菌生物学特性与浮游菌显著不同, 环境适应能力更强, 不仅可以逃避宿主免疫作用,而且在感染部位难以彻底清除, 可抵抗吞噬细胞作用, 逃避宿主免疫, 尤其是耐药性极强, 使BF 相关感染的临床治疗变得非常棘手，常常是临床上难治性持续感染的重要原因之一。4广泛持续的抗生素压力下一些重要的人畜共患病病原发生变异并导致疾病多样性，对人类的健康和畜牧业的健康持续发展构成严重威胁。多种抗生素的滥用，导致细菌在抗生素压力下形成生物被膜以适应生存的需要。生物被膜的形成，不仅使细菌在耐药的过程中发挥屏蔽作用，而且与其它耐药机理相互影响。本研究旨在通过抗生素压力下大肠杆菌生物被膜体外模型的建立，阐明在模拟的抗生素环境下大肠杆菌的生物被膜耐药机理研究，对保证人类健康和畜牧业的健康发展具有重要的社会意义，同时为兽医临床合理应用抗生素提供理论依据。研究细菌生物被膜和耐药性的关系，不仅有助于了解耐药性的发生机理，而且对实际生活中避免和解决由细菌生物被膜引起的相关疾病的治疗也有一定的指导意义。目前国内外多采用分子生物学手段，对生物被膜进行基因水平的研究，通过基因敲除等手段，比较敲除前后细菌形成生物被膜的生理生化状态的改变。同时借助于报告基因如绿色荧光蛋白（GFP）进行标记，通过激光共聚焦显微镜等观测手段对生物被膜的行程进行实时监控，观测在生物被膜的形成过程中，细菌生物被膜的动态变化过程。此外，借助于生物芯片（microarray）技术，对生物被摸形成过程中感兴趣的基因进行上调和下调的表达水平检测，研究在生物被膜形成的不同阶段，相关基因相互作用的机理及其之间的联系，以阐明生物被膜的形成和发展变化的机理。荧光定量PCR(qRT-PCR)技术的应用，使研究者对生物被膜形成相关感兴趣基因进行实时定量的研究成为可能，通过比较在不同阶段浮游菌和生物被膜菌相关耐药基因的表达量变化差异，阐明相关耐药机理与生物被膜的区别与联系，并从分子水平上研制基因芯片。2. 研究内容2.1 实验材料2.1.1 菌株120例样本，于2007年11月2008年2月期间，采集于前来华南农业大学动物医院就诊的宠物（包括猫、狗等）的肛拭子，鼻咽拭子，尿液，创伤感染部位及部分病死宠物的肠内容物，首先要先采集样本，进行分离培养鉴定，最后收集到目的菌种，即临床宠物源性大肠杆菌。大肠埃希菌质控菌ACTT25922本实验室保存。2.1.2 化学试剂2%虎克结晶紫，33%冰乙酸，99%甲醇，TSB（胰蛋白胨大豆肉汤培养基）购于广州环凯生物公司。培养基购自广州环凯生物公司，生化鉴定管购自杭州天和公司 25水溶液戊二醛，上海化学试剂采购供应五联化工厂生产，96.0无水氯化钙，天津市大茂化学试剂厂生产，99.8硝酸银，天津市大茂化学试剂厂生产，99.0对苯二酚，天津市化学试剂一厂生产，99.0硫代硫酸钠，天津市大茂化学试剂厂生产。2.5%戊二醛溶液、PBS 缓冲液（pH7.4）、1%锇酸、50%，70%，80%，90%，100%乙醇、醋酸异戊酯、二氧化碳。医用硅胶购自医用硅胶研究所，TSB（胰蛋白胨大豆肉汤培养基）购于广州环凯生物公司。Buffer、dNTP、酶、EB替代物、PBS缓冲液、琼脂糖等。卡那霉素、多西环素、头孢噻呋、阿米卡星、利福平、恩诺沙星、阿奇霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟、黏杆菌素、安普霉素、氟甲砜霉素、头孢曲松、阿莫西林+克拉克酸等药物。2.2 实验主要内容2.2.1实验的大致线路及流程常规方法对临床分离的宠物源性大肠杆菌进行成膜能力的初步筛选改良结晶紫初染进行半定量鉴定银染法快速进行定性鉴定扫描电镜（SEM）确认鉴定采用微量肉汤稀释法测定MIC值分析比较耐药谱型与生物被膜表型之间的关系。利用PCR技术扩增生物被膜耐药相关基因，分析比较基因型与生物被膜表型之间的关系。耐药谱型和基因型与宠物源性大肠杆菌生物被膜表型关系研究2.2.2 宠物源性大肠杆菌生物被膜模型的建立把分离培养鉴定的目的菌种接种于TSB肉汤中，其中肉汤中放置一片0.04cm2的医用硅胶片，让大肠杆菌附着于硅胶上生长，并形成生物被膜。12.2.3改良结晶紫初染进行半定量鉴定用微孔板方法进行生物被膜结晶紫染色，按照(Stepanovic et al., 2004)的步骤进行。在无菌96孔平底组织培养板的三个孔加入200 ul经1：100稀释好的菌液，阴性对照只加入相应量的TSB肉汤。并盖上平板盖子后，37厌氧培养24小时，然后弃去每孔内培养液并用250ul灭菌TBS溶液漂洗三次，在洗涤过程中要剧烈甩动以彻底弃去孔内未粘附的浮游菌，孔壁上粘附的细菌用200 ul99%甲醇固定15分钟后弃去室温下自然风干。然后，96孔板用200 ul2%虎克结晶紫进行革兰氏染色5分钟，将96孔微量培养板浸没在流动的自来水下冲洗干净多余的染料。待微孔板过夜自然风干后，结合在孔内的染料用160 ul 33%冰乙酸溶解，用酶标仪测定各孔的OD570值。每个细菌接种4孔，每个菌做三次重复。所有的实验进行三次重复并取其平均值作为最终的实验结果。5 62.2.4 生物被膜定性研究2.2.4.1银染法快速进行定性鉴定按照参照文献49，69，70的方法并进行改进优化，进行快速银染鉴定，具体步骤如下：先取出培养好的生物被膜硅胶片，经灭菌生理盐水多次充分漂洗以彻底去除硅胶片表面的浮游菌；在2.5 %戊二醛PBS溶液中静止固定1h；蒸馏水清洗1min除去硅胶片表面的戊二醛溶液；经过饱和氯化钙溶液结合15min后；灭菌蒸馏水清洗10-15min；然后经5%硝酸银染色15min；1%对苯二酚显色2min；蒸馏水清洗1min；5%硫代硫酸钠固定2 min；蒸馏水清洗1min.然后用吸水纸将硅胶片表面的水分彻底洗干，观察是否有黑色物质存在，同时用显微照相系统确认生物被膜的形成，并用空白硅胶片作空白对照。7 8 92.2.4.2扫描电镜（SEM）定性实验（1）将经过24孔微孔板培养一定时间的硅胶片取出，每个样品三块，灭菌蒸馏水清洗表面的培养基后，放入2.5%戊二醛溶液中4进行前固定2-4h；（2）用4放置的PBS 缓冲液（pH7.4）浸洗三次，每次10min；（3）1%锇酸进行后固定1h；（4）50%，70%，80%，90%，100%乙醇进行室温梯度脱水处理，其中50%，70%，80%和，90%各进行一次脱水处理，每次10min；100%乙醇进行连续两次的脱水处理，每次10min；（5）醋酸异戊酯过渡干燥两次，每次15min；（6）二氧化碳临界点干燥：10以下放液2-3次20停留20min，升温至35压力至73kg时以0.5-1/min流量放气；（7）镀膜处理：将样品放在载物台，在8mA的电流条件下，对制备样品进行白金镀膜处理8min。2.2.5相关基因的PCR鉴定进行对菌种进行DNA进行抽提，将抽提的DNA保存在20的冰箱中；在EP管中按照每个模板23ul的量加入17.5ul的水、2ul的dNTP、2.5ul的buffer，2ul的引物（包括上游引物和下游引物）、0.125ul的酶，涡旋均匀之后进行分装，分装到120个小EP管中，再往其中各加入各菌种DNA2ul。然后把120个样品放于PCR仪中，按照设定好的温度程序进行扩增；10PCR完成之后把样品进行电泳试验检测，观察是否扩增出目的基因。2.2.6 MIC实验然后利用微量肉汤稀释法进行MIC值测定，根据NCLLS标准对120株临床分离株进行MIC值测定，同时以ATCC25922作为质控菌，每个药物做3次重复，以不出现浑浊的孔所对应的最低药物浓度作为该药的最小抑菌浓度，即MIC值。23. 试验结果与讨论3.1 改良结晶紫定量实验 生物被膜成膜能力测试结果如下表1所示，根据参考文献方法分为四个表型：OD570比值1的菌种为无成膜能力，1OD570值2的菌种为弱成膜能力的，2 OD570或=4的菌种为强成膜能力。3 表1：大肠杆菌生物被膜表型分布规律由此可以看出，菌种成膜能力弱的菌种占大多数，成膜能力中等的菌种次之，成膜能力强和无成膜能力的菌种较少。3.2 生物被膜定性研究 空白对照的银染照片 第一天各菌株生物被膜的银染照片 第三天各菌株生物被膜的银染照片 培养第七天各菌株生物被膜的银染照片 培养一天的电镜照片（X6400） 培养第三天的电镜照片（X6400）3.3 生物被膜表型和基因型之间的关系以下为各菌种四种生物被膜表型和以下九种基因型之间的关系柱状图：（以百分比来表示） 3.4 生物被膜表型和十五种药物耐药谱型之间的关系以下为各菌种四种生物被膜表型和以下十五种药物耐药谱之间的关系柱状图：（以百分比来表示），从图中可以看出，除了各成膜能力表型对利福平的耐药率较高外，其余各种抗菌药物的耐药水平均在15%以下，而不同成膜能力表型的菌株的耐药率不完全相同。 3.5 生物被膜表型和耐药谱型之间的关系 以下为各菌生物被膜表型与耐药谱型之间的关系柱状图：（以百分比表示），从图中可以看出，强成膜能力的菌株耐药谱型主要分布在6耐、9耐和10耐，而无成膜能力组主要分布在1耐和8耐，中等成膜能力和弱成膜能力组在各个耐药谱型均有分布。4.讨论4.1 快速银染法作为一种对生物被膜进行定性检测方法，能够较为直观的反映出在生物被膜的不同生长阶段，不同成膜能力表型的大肠杆菌的包外基质分泌量表现出一定的规律性变化。结合改良结晶紫对不同来源的大肠杆菌生物被膜表型能力的定量分析，快速银染法能够对生物被膜能力进行初步的分型和鉴定。Passaricllo C 和孔晋亮等的采用空白吸痰管银染作阴性对照,以相同条件下的BF 菌行扫描电镜观察作阳性对照。实验结果表明,银染法用于观察BF 在药物作用后的变化情况,有较强的特异性和敏感性,能准确反映BF 在药物治疗前后的动态变化情况,并且操作简便,价格低廉,可用于实验室常规操作,适宜临床推广。4.2 在快速银染的过程中，氯化钙饱和溶液对生物被膜的处理影响很大，直接关系着快速银染的质量和成败。尤其是氯化钙处理后的清洗时间的确定对下一步的硝酸银着色影响较大，如果蒸馏水清洗的时间过段，不能够将硅胶片上过多粘附的氯化钙去除，这样在加入硝酸银后，会在硅胶片的表面形成较多的白色沉淀，而且白色沉淀的过大体积和重量在下一步的清洗和硫代硫酸钠透明处理过程中都会造成硅胶片上的生物被膜基质会大量脱落。相反，如果将氯化钙处理后的清洗时间延长，会造成粘附在生物被膜基质上的氯化钙过多的扩散到清洗液中，造成后面的硝酸银染色步骤中实际银染的包外基质的量减小，不能较好的反映生物被膜中包外基质的相对量。因此，在我们的实验过程中发现，氯化钙处理15分钟后，进行10-15分钟的蒸馏水漂洗能够较好的实现快速银染的成功。4.3扫描电镜作为一种定性检测手段，能够对大肠杆菌生物被膜进行较为详细的观察，对不同生长阶段的大肠杆菌生物被膜的性特结构动态变化进行比较，为是我们更加明确在生物被膜的成熟过程中各种形态学变化提供有力的依据。4.4大肠杆菌生物被膜表型能力多样性的分析从我们的实验结果和相关研究表明，在大肠杆菌生物被膜形成的过程中，环境因素的不同以及其遗传背景的不同是影响大肠杆菌生物被膜表型能力相差较大的一个主要原因。这可能与生物被膜