提取质粒实验学习整理.doc

1. 菌液OD值越高，质粒产量越高2. 大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？还要看质粒纯度，纯度一般在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染3. 一般而言gene 导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。4. 用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意，从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑：1.确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。请严格按说明书操作。如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！5. Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现问题基本如下：1。如果是质粒超纯试剂盒，得率偏低，因为Qiagen自己得专利树脂填料，对纯度得要求比对得率得要求高，在超纯质粒的抽提过程中，得率比同类产品要低些，不过OD得比值很好，就是纯度很高。2。如果是质粒小提，快速提取等，基本不出什么问题。有些操作要注意，1。Solution 2,3有没有沉淀。2。细菌培养过程中，有没有抗生素选择压力，不然质粒丢失。4。收获细菌有没有测OD值，有些仅凭目测，呵呵，又差异得。不过，有个建议，质粒小提，快速提取，就不要用Qiagen得了，偏贵。6. 从你跑的电泳来看，你的质粒不是很多，差不多就是300ng,可能你的小片段太少，所以你的小片断那就看不出来了，不知道你大片段分子是小片段的多少倍，一般跑电泳能看到在50ng左右,标准的MARK是每条带是50ng,如果你即使切下来了，但你的小片段太小，也是什么都看不到的，这里有一个大约估计量的公式，小片段的纳克数等于大片段纳克数乘他们分子量的比值7. 提取质粒失败的可能的原因：1：克隆有问题；2：提质粒时裂解时间过长；3：质粒提取试剂盒的溶液有问题；4：有点可能本身拷贝数就比较低，可换感受态重新转化后提质粒8. 做重组质粒转化大肠杆菌，质粒用的pGL3-Basic (长度4818bp),连接的目的片段为1.8kb，通过抗性平板筛选每次都有几个单菌落长出，挑单菌落于LB培养基扩增，之后摇菌提取质粒想做酶切验证是都阳性克隆，但是提取到的质粒具有多个条带，这样的话也就没法做酶切验证了。如图前五个孔为同一平板上的五个单菌落提出的质粒，最后孔为1KB marker。请大家帮忙分析是什么原因，难道是污染？不要跑质粒，因为质粒有开环，半开环，螺旋的，跑出来的条带大小不一样，你先以重组载体作为模板，做PCR，如果有，再做双酶切，跑质粒的话由于质粒的形态不一致就会跑出多个条带，一定要把质粒变成线性的跑才能验证。验证重组载体是否构建成功包括PCR，双酶切和测序，希望能够帮到你。9. 一般marker的DNA是线性的DNA分子。从Ecoli中直接提出来的质粒，一般直接电泳会出现所谓的超螺旋的，线性的，双环断开的。所以在这一步，我是直接拿出测序了。但是我在之前都会再确认下。你可以在提质粒时，先进行下菌液PCR，确定为阳性的克隆再质粒10. 冻存的菌最好拿出来以后先在抗性平板上划线复苏一下 然后再挑去单菌落培养 提取质粒DNA11. 我一般都是50ml离心管加15ml培养基，菌液先活化2小时再接种1:100的比例接，然后培养14个小时吧，第二天用试剂盒提质粒，一般都能提出来，你的提不出来是不是传代次数太多，时间久了质粒丢失，之前有没有保存好的质粒，重新转化一次试试12. 质粒怎么都能提出来的吧，只是是不是你的目的质粒而已，但是每个人操作方法也不同，我觉得你可以一步一步排除原因，首先是你的菌液，先鉴定一下，pcr什么的，确保菌是正确的，然后是摇菌，我们一般认为大肠的生长期为1216h，所以12小时不算长，也可以参考od值，第三就是用试剂盒的操作步骤和方法了13. 提质粒的话我们都是摇将近12个小时的，这应该不是提不出来的原因如果培养时加抗生素了，保证长出来的菌是转化子，提不出来可能是由于质粒的拷贝数太低之前我们做谷棒就是这样，一直提不出来，后来才知道是拷贝数只有不到5，根本就提不出来14. 环状质粒在完整的超螺旋状态下比线性的迁移快，但是如果有nick，会比线性迁移慢，慢多少和胶浓度有关。15. 质粒：超螺旋形式跑得最快，其次是完全线性化的质粒，再就是开环形式，其中完全线性化后才是质粒真正的大小。提取之后质粒一般有两个条带。操作粗鲁的话可能有三条。16. 重组质粒第一步需要鉴定出正确克隆，然后过夜培养提质粒，你提质粒的菌液OD值应该为24。另外你现在选的感受态转化效率没有全是金的T1转化效率高，不行可以换它。测序确认你的目的条带17. 提质粒前要先做菌落PCR或菌液PCR，正确以后再提质粒，提完以后再做酶切鉴定然后送测序。同时你的片段只有110bp应该特别好连，检查你的酶切位点是否正确，载体有没有问题。提质粒时一般如果在加入solutionII的时候不拉丝就不用往下提了18. 正常情况下，质粒是环状的。你提取时，试剂及外力，会对它破坏作用。所以提取出来的质粒，会有环状、开环、线状，三种状态。而每次提取时，这三种状态的比例，是不断变化的。所以一般都用单酶、或双酶切作进一步的鉴定。当然，也有用快而经济的PCR方法来鉴定，这种方法有假阳性的可能。19. 之前从别的老师那接了JM109，我所需要的目的基因在其质粒上（Amp抗性），经摇菌并用20%甘油保存、试剂盒提取、1%琼脂糖凝胶电泳显示单一条带（约2500bp），目的基因能扩增出来。但是过了近一个月，我再用之前保存的甘油菌划线、摇菌、试剂盒提取质粒、1%琼脂糖凝胶电泳显示单一条带（近6000bp）。那么问题来了，同一株菌种提取得到的质粒大小竟然不一样，我又做了几次重复，提取出来的质粒大小都是近6000bp，都能扩增出来我所需要的目的基因！我不知道这是什么原因造成的？可能是两个质粒重组了，这事我也遇到过，用酶切一下再看就好了20. 1.如果连入外源基因，不大可能2500bp，一般来说；。puc18算是很小的了，也有2.7kb，所以你第一看到的是超螺旋状态，至于大小，肯定比2500大。2.一般我们提取质粒，看到的是超螺旋的，如果放置时间过长，也可能产生，解螺旋的，也就是好开环的，电泳速度低，但基本不会全部变成解螺旋的。两次看到的大小不同，个人感觉不大可能是因为构想导致，可能是质粒在大肠杆菌体内形成了二聚体，但这种情况，只是听说过，没有见过。先进行单酶切看看。21. 我提取质粒一般只用了试剂盒里面的前三种溶液（任何试剂盒都有三种溶液，要么是solution I，solution II和solution III，或者Buffer P1，Buffer P2和Buffer P3等等啦，当然这三种溶液可以自己配，本人嫌麻烦就是用的试剂盒里面的），后面的就是嫁接的碱法提取法，从来不用带的柱子，一般3mL菌液提取的质粒大概是2000ng/uL*50uL左右，取1uL电泳检测效果蛮好，后续酶切转染稀释一下用，效果挺好的！22. 可以将洗脱液加热，再过柱子，可过两次增加洗脱效率。还有注意裂解菌时是否都悬浮起来23. 我一般是5-6ml菌液，用35-45ul水洗脱。正常情况下400ng/ul*40ul24. 最多5微升菌液，浓度在一百到两百左右，在260有峰值25. 冻存的菌液可能提取不到质粒。26. 为什么提取的不同质粒有的有好几个条带，有的只有一个条带，而且提取的同种菌里保藏的同种质粒两次提取出来的条带也不一样？再有就是质粒是环状的，那跑琼脂糖凝胶电泳还能判断它的大小吗？有意义吗？你看到的几条带应该分别是超螺旋、开环和复制中间体（小到大），提质粒时操作差别会让这三种形态质粒量上有差异，一条带的时候一般都是超螺旋的。直接电泳只能作为大小的参考，想要确定大小需要单酶切后电泳27. 我们实验室是用axygen的质粒盒进行质粒提取的。这几天一直在提质粒，但是效果并不是很好，主要原因是在加入s2和s3之后，10min离心，这之后产生的上清很少。之前提取都是产生一团白色的贴壁物质，现在变成了一团白色伴有半透明的水包，这样子产生的上清很少，求指导是什么原因！研一狗问的问题很低端，求大神解答！这种情况最大可能性是菌液使用量太大了。减少菌液使用量再试试。裂解没做好估计是菌液没有裂解完全，或者离心的转数小了！28. 质粒