抗球蛋白试验标准操作规程.doc

抗球蛋白试验标准操作规程1.检验目的保证抗球蛋白试验符合要求。2.检验方法 本试验包括“直接抗球蛋白”和“间接抗球蛋白”试验。2.1直接抗球蛋白试验2.1.1 原理患者体内若有与红细胞抗原不相合的不完全抗体存在，可与红细胞结合形成抗原抗体复合物。但因不完全抗体分子量小，不能有效地连接红细胞，仅使红细胞处于致敏状态。加入抗球蛋白血清，与红细胞上吸附的不完全抗体结合，在致敏红细胞之间搭桥，出现肉眼可见的凝集。这种直接检测体内被抗体或(和)补体致敏红细胞的试验称之为直接抗球蛋白试验。直接抗球蛋白试验主要用于检查受检红细胞是否在体内已被抗体或者补体致敏，用于新生儿溶血病，溶血性输血反应，自身免疫溶血性贫血，药物诱导溶血性贫血等检查。2.1.2.标本EDTA抗凝的静脉血2.0ml。 2.1.3.试剂多特异性抗球蛋白试剂、抗IgG、抗C3d；2.1.4.器材 离心机、小试管、刻度吸管或加样器（50200l）、37水浴箱等。2.1.5.操作步骤2.1.5.1.取3支试管分别加入多特异性抗球蛋白试剂、抗IgG、抗C3d试剂各1滴，然后再加1滴受检者三洗后的2-3%红细胞悬液，混匀。2.1.5.2. 各反应管以3000r/min离心10秒，持一定的角度轻轻地摇动试管直到松动所有细胞。先用肉眼观察管底红细胞的凝集，再用低倍镜观察。2.1.5.3.对照：用IgG致敏细胞（抗D血清加Rh阳性细胞，37水浴30分钟，洗3次配成3%红细胞盐水悬液）作为多抗及单抗IgG的阳性对照，阴性对照用正常人AB型血清与正常人“O”型红细胞反应。2.1.6.结果判断先观察阴性和阳性对照管，阴性对照管无凝集，阳性对照管出现凝集，说明检测管结果可信。如被检测管凝集，直接抗球蛋白试验阳性，不凝集者为阴性。如实验结果阴性要加试剂对照细胞检查，对照阴性实验结果可靠。2.1.7注意事项2.1.7.1.标本采取后应立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞中丢失。2.1.7.2.抗球蛋白试剂应按说明书最适稀释度使用，否则可产生前带或后带现象而误认为阴性结果。2.1.7.3.受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。2.1.7.4.最好对阴性结果进行核实，即在该试管中再加1滴IgG致敏红细胞，如结果为阳性，则表示试管内的抗球蛋白试剂未被消耗，阴性结果可靠。2.1.7.5.红细胞上吸附抗体太少或Coombs试验阴性的自身免疫性溶血性贫血患者，直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。2.2.间接抗球蛋白试验2.2.1. 原理用已知抗原的红细胞检测受检者血清中相应的不完全抗体；或用已知的不完全抗体检测受检者红细胞上相应的抗原。在37条件下孵育，若被检血清或红细胞有对应的不完全抗体或抗原，抗原抗体作用使红细胞致敏，再加入抗球蛋白试剂，与红细胞上不完全抗体结合，出现肉眼可见凝集。这种通过体外将人血清致敏红细胞后，再检测红细胞上有无不完全抗体或补体吸附的试验称为间接抗球蛋白试验（indirect anti-globulin test，IAT）。主要用于检测受检者血清中游离的不规则抗体，可应用于抗体筛查，抗体鉴定，血型抗原鉴定及交叉配血实验等。2.2.2.标本EDTA抗凝的静脉血2.0ml。2.2.3.试剂多特异性抗球蛋白试剂、IgG、C3d；已知抗体血清（用于检测特殊红细胞抗原）；5已知抗原的红细胞盐水悬液（用于检测血清中不完全抗体）；2-3 D阳性红细胞盐水悬液（阳性对照用）；不完全抗D血清；AB型血清。2.2.4.器材 离心机、小试管、刻度吸管或加样器（50200l）、37水浴箱2.2.5操作步骤2.2.5.1.收到标本和检测申请单 , 先核对标本的试管编号或 / 和姓名与申请单上内容是否相符。 做好标本接收记录。2.2.5.2.取小试管 4 只 , 标记并分别加入待检血浆 2 滴。2.2.5.3. 以上 4 管中分别加入抗体筛选细胞、以及自身红细胞悬液各 1 滴 , 混匀。 2.2.5.4.另取小试管1只做阳性对照：加入3%D阳性细胞，再加入IgG抗D血清2滴。2.2.5.5.另取小试管1只做阴性对照：加入3%D阳性细胞，再加入AB型血清2滴。2.2.5.6.各反应管混匀，置 37 水浴箱孵育 30 分钟 。2.2.5.7. 将各管中红细胞用生理盐水洗涤三次 , 末次离心后必须尽量弃去上清液（在吸水纸上扣干）。 2.2.5.8.各管加多特异性抗球蛋白试剂各 l滴 , 混匀 , 以3000r/min离心10秒, 肉眼判断红细胞凝集情况。2.2.6.结果判定2.2.6.1. 抗体筛选细胞、号 3 管中任一管出现凝集 , 并且“自身对照”管中无凝集现 象自则表明间抗试验阳性。2.2.6.2. 抗体筛选细胞、号 3 管均不凝集 , 则表明间抗试验阴性。2.2.7.注意事项2.2.7.1.红细胞洗涤应迅速、彻底。要将生理盐水用力冲入管底，使管底红细胞松散分离。要防止手上的蛋白质污染。1滴14000稀释的血清可中和抗球蛋白血清1滴，导致假阳性结果。2.2.7.2.离心速度和时间非常重要，应取能使阳性对照管出现阳性反应的最小离心力和最短离心时间。2.2.7.3. 当红细胞上抗体数量较少，可通过反复离心、摇动，再离心的方法，增加抗原抗体的接触，提高阳性率。2.2.7.5.如果检测的抗体为补体依赖抗体，则必须加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。2.2.8.红细胞洗涤本方法适合于少量红细胞的试管法洗涤 , 红细胞的量不超过 5 滴 25% 红细胞悬液中含有的红细胞。2.2.8.1.摇动试管 , 使试管中不存在贴壁的红细胞。2.2.8.2.向试管中加入盐水 , 约至试管总容量 2/3 处。