超表达MfCOR1提高转基因烟草抗寒性和生物量

1 超表达MfCOR1提高转基因烟草抗寒性和生物量 摘 要：黄花苜蓿（Medicago falcalta）是一种非常耐寒的豆科牧草，是苜蓿抗 性育种的重要基因库。在本实验室已构建了黄花苜蓿响应低温的 cDNA 消减 文库基础上，从中选择一个 cDNA 片段克隆其 cDNA 全长 605 bp，含有 579 bp 的开放阅读框，编码一个由 192 个氨基酸组成的蛋白。在 GenBank 中尚 无与该蛋白同源性高的序列，将编码该蛋白的基因暂命名为 MfCOR1（Medicago falcalta cold responsive gene 1）。该蛋白高度亲水，N-端含 有叶绿体信号肽，推测其存在于叶绿体基质中。利用半定量 RT-PCR 技术， 分析了该基因在低温胁迫下的表达规律，在低温处理 2-4 h 时其表达已明显 受到诱导，低温处理 8-96 h 后其表达量一直维持在高水平，初步证明 MfCOR1 是低温诱导基因。构建了超表达载体 pBI-MfCOR1，通过农杆菌介 导法转化烟草获得了转基因植株，经过 PCR 检测筛选出 51 株阳性植株，挑 选其中 15 株进行 Southern 杂交分析，结果表明这些转化植株来自不同的转 化事件。选择其中 3 个单位点的转基因植株 T1代幼苗进行 Southern 杂交和 RT-PCR 检测，结果表明转基因能稳定遗传并且能表达。进一步比较测定了 低温胁迫对转基因植株 T1代幼苗及其野生型对照的影响，转基因株系在冷、 冻胁迫下相对电导率的升幅和在冷胁迫下净光合速率的降幅均低于野生型， 表明显著提高了抗寒性，充分证明 MfCOR1 是一个耐寒基因，与植物抗寒性 密切相关。转基因株系还表现为正常生长条件下苗期生物量显著增大，这与 其具有更高的光合速率有关。研究结果表明，MfCOR1 是一个新的耐寒基因， 可能参与叶绿体光合作用，提高植物的光合速率，促进苗期的生物量积累， 是一个很有应用潜力的新基因，可应用于改良农作物的抗寒性和提高生物产 量。 2 关键词：耐寒基因 克隆 转基因烟草 抗寒性 生物量 Overexpression of MfCOR1 in Transgenic Tobacco Improves Cold Resistance and Biomass Abstract: Medicago falcata is a kind of Leguminosae forage grasses which has strong tolerance to cold stress. Because of its great resistance to cold, drought and leanness, Medicago falcate serve an important gene pool for crop resistance breeding. A SSH cDNA library of cold-responsive gene in Medicago falcata has been established in our laboratory, in which MfCOR1 gene has been shown to be cold-induced. The full length of MfCOR1 cDNA is 605 bp, which contains an open reading frame (ORF) of 579 bp and encodes a peptide of 192 amino acids, but no obvious homological sequence has been found in GenBank. The bioinformatics analysis indicats that the hydrophibic domain is dominant in the structure of MfCOR1 protein which has a predicted signal peptide of chloroplast and might be localized in stroma of chloroplast. The expression pattern of MfCOR1 was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The expression of MfCOR1 is rapidly induced in response to low temperature, and sustained at high expression level up to 96 h after treatment. The over-expression vector of MfCOR1, pBI-MfCOR1, was constructed. The transgenic tobaccos were generated using Agrobacterium-mediated transformation. The transformant plants were analyzed using molecular determinations. PCR detection screens 51 positive MfCOR1 transgenic lines. 15 MfCOR1 transgenic plants were further analyzed by Southern blot. Southern blotting indicates that MfCOR1 integrate into the genome 3 of tobacco from different transformed cases. Southern blot and RT-PCR analysis of 3 T1 plant lines indicates that MfCOR1 could inherite stably and express fully in the transgenic tobacco. Further investigation demonstrate that under low temperature stress the transgenic tobacco lines, compared with the wild type, has a lower increase in comparatively conductance and decrease in net photosynthetic rate. The transgenic tobaccos showed stronger cold resistance than the wild type, and MfCOR1 was full proved to be a cold tolerance gene. The results showed that MfCOR1 is closely related to plant cold resistance. Under optimum growth conditions, the transgenic tobaccos have a higher biomass than wild-type plants, as the result of the increase in the net photosynthetic rate in transgenic tobaccos. The results showed that MfCOR1 is a novel cold tolerance gene; it may be concerned with photosynthesis, raise photosynthetic rate and biomass accumulation rate in seedling stage. In a word, MfCOR1 has great application potential in the aspect of improving cold resistance and production. Key words: cold tolerance gene cloning transgenic tobacco cold resistance biomass 低温是制约植物生长、降低其产量的非生物因素之一。低温不仅在很大 程度上限制植物的种植范围，还会造成作物减产和品质下降，严重时甚至导 致作物绝收。据统计，全球每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿元 （Deng et al, 2001）。在我国北方，晚秋和早春时期发生的低温危害常给越冬 作物和果木造成严重的伤害。而2008年春节前后，我国南方遭受的持续低温 Comment 木木木木1: 删除 Comment 木木木木2: 删除 Comment 木木木木3: 也 4 和冰雪侵袭，更给农业生产带来巨大损害。随着基因工程技术在作物品种改 良方面取得了巨大进展，具有可控性强、效率高、周期短、成本低等优点的植 物基因工程技术已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径（黄文攻等, 2006）。因而，随着分子生物学研究技术的发展，揭示植物耐寒分子机制，分 离和鉴定耐寒基因，有利于广泛开展抗寒基因工程的研究与应用，有效地提 高植物的抗寒性，减少低温伤害造成的经济损失，具有重要科学意义与潜在 应用价值。 黄花苜蓿（Medicago falcalta L.），是豆科苜蓿属多年生草本植物，广泛分 布于亚洲和欧洲，因起源于西伯利亚而具有非常强的耐寒性。同时，还具有 抗旱和耐贫瘠等特性，是苜蓿抗性育种的重要基因库。黄花苜蓿草质优良， 适口性好，是我国北方寒冷地区的主要优良牧草之一，具有重要的饲用价值、 遗传育种价值和生态价值（王俊杰等, 2008）。对苜蓿低温胁迫的研究，过去 主要着重于形态结构、生理特性以及不同抗性品种比较等方面（韩瑞宏等, 2005），而耐寒分子机制方面研究不多。已经在紫花苜蓿（Medicago sativa L.） 和黄花苜蓿鉴定过的低温驯化特异基因（cold acclimation-specific），包括 msaciA、SM2075、SM2201、SM2358、msaCIC、cas15、cas17、cas18（蔺忠龙等, 2009）。业已证明，低温引起细胞内Ca2+浓度短暂性增加是诱导冷适应基因 cas15表达所必需的（Monroy et al, 1995）。进一步研究揭示，Ca2+通过使蛋白 磷酸酯酶失活诱导cas15的表达（Monroy et al, 1998）。最近，通过对蒺藜苜蓿 （Medicago truncatula L.）和黄花苜蓿cas15和cas30的启动子比较分析，解释 了这两个基因在两种耐寒性差异较大的材料间响应低温表达差异的原因，可 能与CRT/DRE调控元件在启动子区的拷贝数有关（Pennycooke et al, 2008）。 但总的来说，目前对黄花苜蓿耐寒分子机制研究不多，已鉴定的少数几个cas 基因的功能及其调控抗寒性的机制仍不清楚。本实验室采用抑制性消减杂交 技术（SSH），构建了黄花苜蓿响应低温的cDNA消减文库，获得一批受低温诱 5 导表达的基因片段（Pang et al, 2008）。 本研究从黄花苜蓿响应低温的cDNA消减文库中选择1个cDNA片段 （GenBank注册号为ES323184），克隆其cDNA全长，发现它是一个未知功能 的基因，暂命名为MfCOR1。通过转基因技术使其在烟草中过量表达，并对T1 代转基因烟草进行抗寒性、生长状况及光合速率分析，为深入研究该基因调 控植物抗寒性的机制，进行作物抗逆基因工程育种打下基础。 1 材料与方法 1.1 材料培养与处理 黄花苜蓿品种呼伦贝尔（Medicago falcata L. cv. Hulunbeier）种子用 60 热水浸泡 5 min 后，在 28 黑暗条件下催芽，露白时点播于塑料盆中，于温 室内培养，自然光照，温度 25-28 。2 个月后将幼苗移入人工气候箱进行低 温（4 ）处理，人工气候箱光照强度为 200 mol/ m2s，光周期为 14 h。分别在 处理 0、2、4、8、16、24、48 及 96 h 后取样，取样时剪取成熟叶片，用锡箔纸 包好后投于液氮迅速冷冻，于-80 冰箱中保存备用。 1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成 以 Trizol 法提取总 RNA。取 0.15 g 叶片，用液氮快速研磨成粉末，转移 至 2 mL 离心管中，加入 1.5 mL TRE-Trizol（广州博理生物科技公司）试剂， 剧烈振荡 15 sec，冰浴 5 min。10000 r/m 离心 5 min，吸取上清至 2 mL 离心 管，加入 0.3 mL 氯仿，剧烈振荡 15 sec，冰浴 10 min。12000 r/m 离心 15 min，吸取上层水相（0.7 mL）至 1.5 mL 离心管，依次加入 0.4 mL 异丙醇和 0.4 mL BufferA（1.2 mol/L 氯化钠，80 mmol/L 柠檬酸钠，用 DEPC 处理水配 制），立即混匀，室温下放置 10 min。12000 r/m 离心 10 min，弃上清，用 75% 乙醇（DEPC 处理水配制）洗涤沉淀。7500 r/m 离心 5 min，弃上清，再短暂离 心 3 sec，用枪头吸尽上清。室温下风干沉淀 5 min，加入 30-35 L DEPC 处 理水，60 温浴 5 min，溶解沉淀。取 1-3 L 总 RNA 进行甲醛变性胶电泳， 6 检查 RNA 的完整性，并测 OD260与 OD280，确定总 RNA 的浓度与纯度。 参照 Promega 公司 M-MLV 反转录酶试剂盒说明书，以 Oligo (dT)18为引 物进行反转录，合成 cDNA 第一链。反转录体系及程序为：总 RNA 2 g，Oligo (dT)18 (100 nmol/L) 1 L，加 ddH2O 补足体积至 10 L，混匀，70 保温 5 min，迅速冰浴 5 min。继续加入以下反应物：M-MLV 5 Reaction Buffer 5 L，dNTPs（10 mmol/L each）1.25 L，RNase 抑制剂 0.5 L (25 U)，M-MLV RT 1 L (200 U)，加 ddH2O 至终体积为 25 L，轻弹管壁，混匀，短暂离心。42 反应 60 min，70 灭活 10 min。反应结束后，于20 冰箱中保存备用。 1.3 设计特异引物 根据本实验室已构建的黄花苜蓿响应低温的 cDNA 消减文库中 MfCOR1 cDNA 序列（注册号为ES323184），在 NCBI 上进行 BLAS Test，并 下载相应序列。利用 DNAStar 软件的 Seqman 工具进行序列拼接，如此反复 直到拼接得到该基因的全长序列。通过 DNAStar 软件分析以上全长序列的 开放阅读框，根据开放阅读框两端的序列设计上游引物（5 CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA 3）和下游引物 （5 CTTACTCCTTCCCAGCCACGA 3）（由 Invitrogen 公司合成）。 1.4 MfCOR1 cDNA全长的克隆与测序 以低温处理黄花苜蓿叶片的 cDNA 为模板，利用 Ex Taq DNA 聚合酶 （TaKaRa 公司) 进行 PCR 扩增，获得 MfCOR1 cDNA 全长。 PCR 扩增条件 为：94 预变性 5 min，94 变性 30 sec，57 退火 30 sec，72 延伸 40 sec，30 个循环。最后 72 终延伸 10 min。PCR 产物用 1琼脂糖凝胶电泳， 检测片段大小和质量。用凝胶回收试剂盒（东盛公司）回收的 PCR 产物与 pMD20-T 载体（TaKaRa 公司）连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 菌 株，筛选重组子。得到的重组克隆（pMD-MfCOR1）经鉴定后由广州拓普生物 工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。 7 1.5 半定量RT-PCR 以持家基因 -actin 作为半定量 RT-PCR 内参照。根据本实验室已有的 - actin 引物 ZG101 (5 TTGGATCTTGCTGGTCGT 3)和 ZG102 (5 GATCCTCCAATCCAGACA 3）进行 PCR 扩增，取 0.5-2 L 反转录 cDNA 为模板，退火温度 60 ，反应 23 个循环，根据电泳条带的亮度确定模板上样 量，反复调整，直到各样品扩出的条带亮度一致。参照 1.4 的 PCR 反应，用 1.3 设计的特异引物检测 MfCOR1 的 mRNA 丰度，先做不同循环数的梯度，选取 线性增长期内的循环数来做定量分析。 1.6 植物表达载体的构建 设计一对分别组入 Xba和 BamH酶切位点的引物， pMD1 (5 GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCTTATGG 3)和 pMD2 (5 GTGATCTAGAGCTTGGTACCCAGAAATCCGA 3)，以克隆质粒 pMD- MfCOR1 为模板, 利用 KOD-Plus-DNA 聚合酶（TOYOBO 公司) 进行 PCR 扩增。经 PCR 产物凝胶回收试剂盒（东盛公司）回收并定量后，以 Xba和 BamH双酶切。酶切体系及方法参考 TaKaRa 公司商品酶说明书。酶切产物 以 0.8的琼脂糖凝胶电泳分离经试剂盒回收后, 克隆到经 Xba和 BamH双酶切的 pBI121 植物超表达载体中, 转化大肠杆菌 DH5，筛选重 组克隆，并分别进行 PCR 和酶切鉴定。重组质粒命名为 pBI-MfCOR1。 1.7 农杆菌介导法转化模式植物烟草 1.7.1 烟草无菌苗的培养 烟草（Nicotiana tabacum L.）品种中烟90种子经70乙醇和0.1升汞消毒 后，接种于MS培养基上，28 光照培养约1个月。待展开5-7片真叶时，即可用 于农杆菌转化。 1.7.2 农杆菌的活化与悬浮 将重组质粒pBI- MfCOR1转化根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 8 EHA105菌株，在YEB平板（含35 mg/L的Chl和50 mg/L的Kan）上筛选获得阳性 农杆菌。挑分离良好的单菌落于2 mL含同样抗生素的液体YEB中28 振荡暗 培养24-48 h。吸取菌液20-50 L涂布于含同样抗生素的YEB平板上，28 倒置 暗培养24-36 h。将新长出的农杆菌刮下来，用MS液体培养基悬浮稀释，使 OD600为0.8-1.0。 1.7.3 侵染、共培养及抗生素筛选 将 1.7.1 培养得到的烟草无菌苗叶片用剪刀剪成 1 cm2大小的叶盘，并用尖 嘴镊子在表面戳小孔，制造伤口，转入农杆菌菌液中浸泡，其间不时摇匀。浸 泡 15 min 后用无菌吸水纸吸去表面多余菌液，稍吹干，置于垫了滤纸的 MS1 培养基（MS 基本培养基添加 0.1 mg/L 的 NAA 和 1 mg/L 的 BA）上，28 黑暗 共培养 2-3 d。将经过共培养的材料转移至 MS2 培养基（MS1 培养基添加 250 mg/L 的 Carb 和 100 mg/L 的 Kan），28 光照培养，20 d 继代一次。将成功再 分化的苗转至培养基 MS3（MS 基本培养基添加 250 mg/L 的 Carb 和 100 mg/L 的 Kan）上生根，待长出 5-7 片真叶时，开瓶炼苗，移栽到土中。 1.8 转基因烟草的分子检测 1.8.1 PCR 检测 按照微量法快速提取转基因烟草的基因组DNA，进行PCR检测。以烟草 基因组DNA为模板，使用1.3中上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为： 94 预变性5 min，94 变性30 sec，57 退火30 sec，72 延伸40 sec，30个 循环。最后72 终延伸10 min。PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳，检测片段大 小和质量。 1.8.2 Southern杂交分析 按照CTAB 法（Saghai et al, 1984）提取转基因及野生型烟草基因组DNA , 取50 g DNA，用EcoR I消化后在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳, 用毛细管法 将DNA转移至尼龙膜Hybond N+（Amersham公司）。以Mf COR1片段为杂交的 Comment 木木木木4: ， 9 探针, 用随机引物标记试剂盒进行放射性同位素32P标记，参照Guo等（2003） 的方法进行杂交和洗膜。 1.9 转基因植株的抗寒性分析 1.9.1 相对电导率的测定 将表面灭菌的 T1代种子点种于 MS 培养基（含 100 g/ mL 的 Kan）上， 28 光照培养约 10 d，将存活幼苗移到 MS 培养基中培养 4 周，进行冷、冻处 理。将组培苗移到 15 的人工气候箱中培养 1 d 再以 8 处理 3 d，光照强 度为 200 mol/m2s，光周期为 14 h（冷处理）；将组培苗移到 15 的人工气候 箱中培养 12 h，8 培养 8 h，4 培养 4 h 后，置于-4 处理 3 h（冻处理）。处 理结束后，取叶片（约 15 片）放入含 25 mL 去离子水的三角瓶，在摇床上低 速（30 r/min）摇动 2 h 后，参照 Lutts 等（1996）的方法测定相对电导率。 1.9.2 光合速率的测定 将以上经卡那霉素筛选，在 MS 培养基上生长 5 周的幼苗移栽到装土的 培养盆中，于温室内培养，自然光照，温度 25-28 ，2 个月后于人工气候箱 中进行低温（5 ）处理，以 25 为对照，光照强度为 200 mol/m2s，光周期 为 14 h。分别于处理 2、6、8 d 后进行光合速率测定。在气温 25 和大气 CO2浓度约 460-490 L/L 条件下，用 Li-6400 便携式光合仪活体测定烟草叶 片净光合速率(Pn)。测定时内置光源光强为 900 mol/m2s。野生型和转基因植 株各测定 3 株，每株系测定 3 次 重复测定平均值。 1.10 统计分析 数据的方差分析用 SPSS 13.0 软件进行，采用最小显著差数法（Least Significant Difference，简称 LSD 法），显著性水平为 P 0.05。文中所有柱形 图的柱上方字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著。 2 结果与分析 10 2.1 MfCOR1的克隆和序列分析 从本实验室构建的黄花苜蓿响应低温的cDNA消减文库中选择1个低温 诱导的cDNA（ES323184），根据其序列及NCBI数据库中Medicago truncatula synuclein mRNA的序列, 利用DNAStar软件的Seqman工具进行序列拼接，如 此反复拼接得到该基因的cDNA全长序列。通过DNAStar软件分析以上全长 序列的开放阅读框，根据开放阅读框两端的序列设计了一对引物。利用RT- PCR从低温（4 ）处理黄花苜蓿叶片cDNA中扩增出一条600 bp左右的带，将 其回收后克隆到pMD20-T载体上。经过序列测定，表明所获得的cDNA全长 为605 bp，含579 bp的开放阅读框，编码一个由192个氨基酸组成的蛋白（图 1）。 将该cDNA序列推导的氨基酸序列与已知的植物氨基酸序列进行同源性 比较分析，未发现与其高度同源的序列。进一步对同源性相对较高的几个蛋 白进行同源性比较，构建了进化树（图2）。结果表明，本研究所克隆的基因是 一个未知功能的基因。由于其来自于黄花苜蓿（M. falcalta），并受低温诱导， 故暂命名为MfCOR1（Medicago falcalta cold responsive gene 1）。 图1 MfCOR1的核苷酸序列及推导的氨基酸序列 （注：出于保密原因，该序列尚未在GenBank注册） falcaltafalcalta 11 图2 MfCOR1的进化树构建 利用ProtParam tool软件预测MfCOR1编码的蛋白质，其理论分子量为 20.0 kD，理论等电点（Theoretical pI）为5.10，是一种偏酸性的小分子量蛋白 质。MfCOR1富含丙氨酸（18.8%）、赖氨酸（10.9%）、苏氨酸（9.9%）、甘氨酸 （7.3%）等亲水性氨基酸, 而疏水性氨基酸如酪氨酸含量很低(1.6%)。使用软 件ProtScale对MfELIP氨基酸序列的疏水性/亲水性预测，依据氨基酸分值越 低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可以看出，MfCOR1具有高亲 水性，亲水性氨基酸分布均匀，中部有2个亲水性特别强的区域（图3）。使用 iPSORT Prediction对MfCOR1进行的亚细胞定位预测，表明在N-端有一个叶 绿体信号肽（图4）。根据以上结果，推测MfCOR1存在于叶绿体基质中。 12 图3 MfCOR1的疏水性/亲水性预测 图4 MfCOR1的亚细胞定位预测 2.2 低温胁迫对MfCOR1表达的影响 在低温（4 ）处理 2-4 h 时 MfCOR1 的表达已明显受到诱导，处理 8-96 h 后 MfCOR1 的表达量一直维持在高水平（图 5）。结果初步证明 MfCOR1 是 低温诱导基因，表明该基因表达可能与黄花苜蓿的耐寒性有关。 MfCOR1 Actin 处理时间（h）（23个循环） 0 2 4 8 16 24 48 96 MfCOR1 Actin 处理时间（h）（23个循环） 0 2 4 8 16 24 48 96 13 图5 低温（4 ）对黄花苜蓿叶片中MfCOR1表达的影响 2.3 超表达MfCOR1的转基因烟草培育及鉴定 将MfCOR1连接到表达载体pBI 121上，构建成过量表达载体pBI- MfCOR1。以农杆菌介导法导入烟草，共获得了58株抗卡那霉素的转基因再 生植株。对它们进行了PCR检测, 结果显示，大部分植株都能扩增出一条与 阳性对照大小一致的条带，51株表现为PCR阳性（图6）。进一步选取其中15株 PCR阳性植株，进行Southern杂交分析，以MfCOR1基因主体片段为探针。结 果显示，编号为W的野生型对照没有杂交信号，而转基因植株中除编号为9的 株系为阴性外，其它14株均有强烈的杂交信号（图7）。由于MfCOR1基因序列 上没有EcoR酶切位点，因此Southern杂交信号的条带数等于MfCOR1在转 基因烟草基因组的插入位点数。结果表明，MfCOR1在编号为 1、3、4、5、6、7、11、13、14的烟草植株基因组中以单位点的形式插入，在编 号为10、12、15的烟草基因组中以双位点的形式插入，以3位点的形式插入了 编号为2、8的烟草基因组中。Southern杂交结果还表明，该基因分别以不同插 入位点数插入烟草基因组的不同位置，这14株转基因烟草分别来自不同的转 化事件。 14 图6 部分转基因烟草的PCR鉴定 M, Marker DL5000; 1-17,转基因烟草植株; P, 质粒pBI- MfCOR1 ; W, 野生型烟草 图 7 部分转基因烟草的 Southern 杂交分析 1-15, 转基因烟草植株; M, DNA/Hind Marker; W, 野生型烟草; P, 质粒 pBI- MfCOR1 进一步对其中 3 个单位点的转基因株系（编号为 5、11、13）T1代 植株进行 Southern 杂交分析，各随机挑选 3 株。结果显示，MfCOR1 在各株系 T1代烟草基因组中均以单位点的形式插入，并且同一株系 不同植株间具有相同的插入位置（图 8 a）。结果表明，MfCOR1 在转基 因烟草中稳定遗传。 采用 RT-PCR 检测此 3 个转基因株系 T1代植株及野生型对照的 MfCOR1 mRNA，结果显示编号为 W 的野生型对照没有条带，而 3 个 转基因植株检测到 MfCOR1 的 mRNA（图 8 b）。结果表明，MfCOR1 在转基因烟草叶片中表达。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 P W 5000bp 3000bp 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 P W 5000bp 3000bp 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 23.0 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb 2.3 kb 2.0 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M W 11 12 13 14 15 P M 23.0 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb 2.3 kb 2.0 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M W 11 12 13 14 15 P M 15 图 8 T1代转基因烟草的 Southern 杂交和 RT-PCR 分析 5 11 13, 转基因烟草株系; M, DNA/Hind Marker; W, 野生型烟草 2.4 T1代转基因烟草的抗寒性分析 通过比较测定低温胁迫下以上 3 个转基因株系的 T1代植株及其 野生型对照的相对电导率以及净光合速率，分析 T1代转基因烟草的 抗寒性。 2.4.1 低温对烟草相对电导率的影响 5 周龄烟草经 8 冷处理 4 d 和-4 冻处理 3 h 后，野生型对照 植株叶片严重脱水萎蔫，并且部分叶片半黄半绿，而转基因烟草叶片 受伤害程度较轻，只有部分叶片轻度萎蔫（图 9）。在常温下，转基因 烟草与野生型对照叶片的相对电导率很低，为 6%左右。而经 8 冷 处理 4 d 后，野生型对照叶片相对电导率升高为 30.5%，而转基因烟 草相对电导率明显低于野生型对照，分别为 17.7%、18.3%、16.5%（图 10 a）。经-4 冻处理 3 h 后，野生型对照叶 片相对电导率升高为 30.2%，而转基因烟草相对电导率分别为 23.0 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb 2.3 kb 2.0 kb 5 11 13 M a b MfCOR1 Actin W 5 11 13 MfCOR1 Actin W 5 11 13 W 5 11 13 Actin （30个循环） 23.0 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb 2.3 kb 2.0 kb 5 11 13 M 23.0 kb 9.4 kb 6.6 kb 4.4 kb 2.3 kb 2.0 kb 5 11 13 M a b MfCOR1 Actin W 5 11 13 MfCOR1 Actin W 5 11 13 W 5 11 13 Actin （30个循环） 16 13.4%、12.6%、13.0%，明显低于野生型对照（图 10 b）。上述结果说明， 在冷、冻处理后，转基因烟草质膜受损程度明显低于野生型对照，提 高了耐寒性。 图 9 冷（8 ）、冻处理（-4 ）对野生型和转基因烟草的影响 图 10 冷、冻处理对野生型和转基因烟草相对电导率的影响 c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 a c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 a c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 a c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b c cd dd b a b b 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冷处理 dd cd c b b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 W51113 植株编号 相对电导率（%） 常温冻处理 a b 株系编号 b 17 a: 冷（8 ）处理 4 d; b: 冻（-4 ）处理 3 h 2.4.2 低温对烟草光合速率的影响 对 3 月龄烟草进行低温（5 ）处理，以常温（25 ）为对照，测定 光合速率。结果显示，在正常生长条件下，转基因植株净光合速率 （Pn）显著高于野生型对照，分别比野生型对照高出 9%、15%、12%（图 11）。常温对照处理中，各株系的净光合速率随时 间的变化不大（图 11 a）。而低温处理导致净光合速率的明显降低，野 生型株系降幅最大，低温处理 8 d 后降到其对照的 54%，而转基因株 系分别为其对照的 84%、71%、60%，野生型与转基因株系间差异明 显（图 11 b）。 图 11 低温处理对野生型和转基因烟草光合速率的影响 0 5 10 15 20 25 W51113 株系编号 净光合速率 （mol CO2 m-2 s-1） 0d2d6d8d 0 5 10 15 20 25 W51113 株系编号 净光合速率 （mol CO2 m-2 s-1） 0d2d6d8d a b ab ab aa b b j c d a a ab ab de e bc bc b bc c d d deee fg h i g 0 5 10 15 20 25 W51113 株系编号 净光合速率 （mol CO2 m-2 s-1） 0d2d6d8d 0 5 10 15 20 25 W51113 株系编号 净光合速率 （mol CO2 m-2 s-1） 0d2d6d8d a b ab ab aa b b j c d a a ab ab de e bc bc b bc c d d deee fg h i g 18 a: 常温（25 ）; b: 低温（5 ） 2.5T1代转基因烟草幼苗的生长情况 在培养转基因烟草幼苗过程中，发现正常生长条件下转基因烟草 长势明显好于野生型。对比 5 周龄苗，转基因烟草株高较野生型高， 叶片较野生型大，根系较野生型发达（图 12）。测定结果显示，T1代转 基因烟草地上部、根系及植株鲜重都明显地高于野生型，植株鲜重分 别为野生型对照的 1.7、2.8、1.7 倍（图 13 a）。叶面积也明显大于野生 型，分别为野生型对照的 1.6、2、1.8 倍（图 13 b）。 图 12 正常条件下野生型和转基因烟草组培苗生长状况（5 周龄苗） 图 13 正常条件下野生型和转基因烟草组培苗生理指标（5 周龄苗） a: 植株各部分鲜重; b: 叶面积 a d c c b f e e cd cd b a b 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 W51113 植株编号 鲜重（g/株） 地上部 根系 植株 株系编号 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 W51113 叶面积（cm2/片） b 株系编号 a ab b c a d c c b f e e cd cd b a b 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 W51113 植株编号 鲜重（g/株） 地上部 根系 植株 株系编号 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 W51113 叶面积（cm2/片） b 株系编号 a ab b c 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 W51113 叶面积（cm2/片） b 株系编号 a ab b c 19 为进一步比较正常生长条件下植株大小，在 5 周龄时，将各实验 株系幼苗移至含 MS 培养基的 250 mL 培养瓶中培养，每瓶种一株， 每株系重复 5 株。比较观察 9 周龄苗的生长情况，发现转基因烟草明 显比野生型高大，无论是地上部还是根系均优于野生型，而且转基因 植株侧根繁多（图 14）。测定结果显示，T1代转基因烟草地上部、根系 及植株重量都大大高于野生型对照，分别是野生型对照的 2.1、4.6、2.4 倍（图 15）。 图 14 正常条件下野生型和转基因烟草组培苗生长状况（9 周龄苗） 图 15 正常条件下野生型和转基因烟草组培苗生理指标（9 周龄苗） d c c ab d d e c cd bc b a 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 W51113 植株编号 鲜重（g/株） 地上部 根系 植株 株系编号 d c c ab d d e c cd bc b a 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 W51113 植株编号 鲜重（g/株） 地上部 根系 植株 株系编号 20 同时，将周龄的转基因植株及其野生型对照幼苗移栽到培养盆 中，在温室自然光照下生长，转基因株系幼苗的生长状况同样明显优 于野生型。整体上，转基因烟草较野生型更健壮，个体更大（图 16）。 结果表明，在正常生长条件下，无论是无菌苗还是盆栽幼苗，转基因 植株的生长显著优于野生型对照。 图 16 正常条件下烟草盆栽苗生长状况 a, 9 周龄苗; b, 13 周龄苗 3 讨论与结论 植物遭受低温胁迫后，数百个基因的表达会受诱导（Fowler et al，2002），多条调节途径参与了植物抗寒性的调控。本实验室构建了 黄花苜蓿冷响应抑制性消减杂交文库，从中筛选出 100 多个阳性克隆， 将阳性克隆对应基因编码的蛋白分为调控蛋白、与损伤修复或生长相 关的功能蛋白以及功能未知蛋白三大类。本研究从该 cDNA 文库中 克隆了一个响应低温的未知功能基因 cDNA 全长，暂命名为 MfCOR1。MfCOR1 预测分子量为 20kD，具有高度的亲水性，其 N-端 含叶绿体信号肽，推测 MfCOR1 存在于叶绿体基质中，可能在光合系 W 11W 11 ab W 11W 11 ab 21 统的运转与调节中起作用。 Weiser 等（1970）最先提出植物抗寒性诱导过程中基因表达发生 改变的观点，揭示出植物抗寒锻炼实质上是感受低温信号、调节基因 的表达和代谢的环境适应过程。MfCOR1 的表达受低温诱导，低温（4 ）处理 2 h 后就明显上调，8 h 后一直维持高水平的表达。初步证明 MfCOR1 是低温诱导基因，表明该基因表达可能与黄花苜蓿的耐寒性 有关。 为验证 MfCOR1 在提高植物耐寒性中的作用，进一步将 MfCOR1 在烟草中过量表达，本文共获得了 51 株转基因烟草，对其中 15 株进 行了 Southern 杂交检测，证明 MfCOR1 以单位点、双位点或多位点形 式整合到了烟草基因组中。选择其中 3 个单位点（株系编号： 5、11、13）的转基因植株 T1代幼苗进一步进行 Southern 杂交检测，它 们均以单位点形式整合到了烟草基因组中，证明转基因能稳定遗传。 RT-PCR 结果证明，