肺炎链球菌研究现况及血清分型.ppt

肺炎链球菌疾病及其防治,1,.,肺炎球菌疾病病原学及流行病学肺炎球菌疾病的诊治方法及耐药机制肺炎球菌疫苗及接种,内容,2,呼吸道传染病室,3,细菌学实验室工作内容,病原学：采样、运输、培养、分离、鉴定、分型、保存抗生素耐药性检测免疫学：血清学、免疫效果评价分子生物学测：PCR检测、分型、聚类、遗传变异、进化分析,4,肺炎链球菌的菌落形态,在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。,5,肺炎链球菌,6,2.Optochin(OP)敏感试验,optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5g/片的optochin纸片，置5-10%CO2的大气中（或烛缸），35孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径12mg/L.,Songetal,JournalofAntimicrobialChemotherapy2004;53(3):457-463.,耐药率（%）,24,中国肺炎链球菌耐药情况,对青霉素耐药2001年耐药率达42%55%，上海地区:对PNC不敏感率为72.7%儿童耐药率高，已发现MIC32mg/L菌株对大环内酯类肺炎链球菌对红霉素等的耐药率为50，多数报道在70以上上海报道53%,23.4%耐药,19.8%中度耐药,56.8%敏感,25,中国肺炎链球菌对青霉素耐药的发展趋势,N=214（2000）,N=564（2004）,N=417(2007),12.王辉等，中华结核和呼吸杂志.2004年3月第27卷第3期.155-16011.王辉等。中华检验医学杂志。2007年11月11期.第1242页-1247页,耐药率(%),(年),PISP,PRSP,26,27,肺炎球菌耐药,多重耐药的肺炎球菌常见且不断增多肺炎球菌耐药性可导致多重后果：治疗失败需要用昂贵的抗微生物药物替代住院时间延长医疗费用增加,28,为什么会出现耐药,由于各种原因使用抗菌药物所造成的选择性压力是导致和加速耐药性产生的最主要因素，而不适当的选用抗菌药、剂量不足、疗程不足、药品质量低劣等同样可导致并加速耐药性的产生,抗生素治疗,选择性压力,肺炎球菌耐药,汪复、张婴元主编.实用抗感染治疗学,2004版,29,30,细菌性呼吸道传染病标本采集,1、急性上呼吸道感染:鼻/咽拭子2、肺炎1）鼻咽拭子/鼻咽抽吸物：2）尿液：3）痰液：4）血液：5）胸腔穿刺液：6）支气管肺泡灌洗液。3、脑膜炎1）脑脊液2）血液,31,肺炎症状、体征影像学诊断，应考虑疾病的进行性改变。病原微生物学诊断：呼吸道分泌物分离培养，受正常菌群影响侵袭性的采样，操作风险、接受程度影响。,鼻/咽拭子,32,血标本,足量血标本，床前接种血培养瓶。成人：每次采样抽血10mL，5mL注入准备好的血培养瓶。儿童：每次采血5mL，3mL注入准备好的血培养瓶血培养瓶有细菌生长，转种培养皿。血清可进行PCR或RealtimePCR检测或抗体检测。建议：不建议用碘伏消毒瓶塞，如用碘伏消毒，应用酒精脱碘。用70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子，酒精作用1分钟；在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。防止皮肤寄生菌或环境微生物引起的污染。芽孢杆菌属、棒状杆菌属、痤疮丙酸杆菌或凝固酶阴性的葡萄球菌、不动杆菌等的标本一般视为污染。,33,脑脊液标本,不增菌，直接接种培养皿可做快速检测（涂片染色、乳胶凝集检测）PCR及RealtimePCR检测,34,培养基及接种培养,普通培养基（血平板、巧克力平板）选择性培养基,35,培养基质量控制,标本接种菌落取菌环划线接种培养鼻咽拭子涂布培养基后，应取菌环划线接种,药敏试验,最后鉴定发出最终报告,初步鉴定菌落特征、菌体形态,直接涂片革兰染色,鉴定试验,检验程序,血平板,营养肉汤增菌,355%-10%CO2,18-24h,35,18-24h,第一天,第二天,第三天,36,细菌鉴定,Gram染色,37,奥普托欣敏感性抑菌环14mm,胆汁溶解试验,触酶试验,生化鉴定,肺炎球菌,流感嗜血杆菌,生物学性状,主要生化反应optochin试验:含5goptochin纸片贴于涂布有待测菌的平板上35孵育过夜，抑菌圈大于14mm即为敏感。,38,血清分型（群）-玻片凝集结果及判读,细菌与一种抗血清凝集，和生理盐水不凝集时，才能鉴定为该种血清型。如果不能确定血清群，菌株为不可分群菌株（NG）或不可分型菌株（NT）。关于NG/NT菌株在生理盐水中凝集，无论与任何抗血清发生强反应，都应标记为自凝菌。在生理盐水中不自凝，和多种血清出现凝集，记为NG。在生理盐水中不自凝，不和任何一个血清凝集，记作NG。,分型血清质量控制,39,乳胶试剂盒,在待检标本上滴加乳胶悬液,混匀,轻摇反应,观察结果,滴加待检标本,乳胶凝集快速检测,40,细菌耐药性检测（1）,K-B纸片扩散法：花费最少，但是结果存在一定的不确定性，该方法可将检测的分离株分为敏感、中介、耐药或对某种抗生素的不敏感。然而，不能提供MIC值，及反映该菌株对抗生素的敏感性减弱趋势。,41,16mm,6mm,CLSI或CA-SFM标准进行比对（核对质控菌株的各项结果是否在质控范围内）,影响因素：MIC、接种菌量、细菌生长率、抗生素含量扩散性、平皿厚度、温度孵育时间,细菌耐药性检测（2）,梯度试纸条法：操作简单方便，连续梯度浓度，稳定性好，检测结果可表示为g/ml，是一种半定量的检测方法。价格较高，结果需要仔细判读,42,细菌耐药性检测（3）,43,MIC肉汤稀释法,MIC琼脂稀释法,可同时检测多株细菌，观察细菌生长状况制备平皿工作量大，抗生素要求精度高,MicrococcusletusATCC9341PenicillinG,70.25U43mm80.13U38mm90.06U35mm100.03U32mm110.015U24mm120.0075U16mm130.0038U8mmBlank0mm,7,11,10,9,8,12,13,Branco,Discsof6mm,CSF标本中抗生素浓度检测,44,肺炎链球菌鉴别流程图,45,肺炎链球菌鉴定试验,46,溶血,奥普托欣试验,荚膜肿胀,胆汁溶解,传统的基于荚膜的肺炎球菌血清分型（群）：多克隆/单克隆抗体,47,荚膜肿胀(金标准）,肺炎链球菌丹麦血清棋盘分型法,1.菌株依赖性2.成本高3.技术操作要求较高4.不同血清之间交叉反应5.结果解释主观性,48,较高的敏感性、特异性，克服交叉反应。经济实用性：减少对传统血清分型的依赖高通量、方案可调整：一次实验可同时完成多个反应，高通量检测血清型，根据当地流行血清型进行组合非培养依赖性：直接从标本中检测肺链及血清型操作简单，结果判断科学客观新的特异的分型引物公布,typespecific,Spn+control,19F315B1810A7F,Controlformultiplexassayreaction2,SequentialmultiplexPCRdeductionofpneumococcalserotypes.Paietal2006.JCM,PCR用于肺炎球菌分型,肺炎球菌PCR与RealtimePCR检测,目标基因包括：lytA基因（自溶素）ply基因（肺炎球菌溶血素）：检测上呼吸道标本时，易产生假阳性结果，一些非肺炎链球菌的-溶血链球菌，这些细菌通常为呼吸道的正常菌群，如Streptococcusmitis和Streptococcusoralis，这些细菌又是也含有ply基因。psaA基因（肺炎球菌表面黏附素）。,49,肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，使用溶菌酶和变溶菌素进行消化，有利于去除细胞壁中的含量较高的肽聚糖，之后进行消化裂解有助于提高DNA的含量。,基于非洲目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案*如果反应2中6A/6B/6C/6DPCR阳性，则开展第9项检测,基于美国目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案*如果反应1中6A/6B/6C/6DPCR阳性，则开展第8项检测,50,肺炎球菌病监测PCR检测注意事项,51,病例定义RealtimePCR灵敏性高，一般用于珍贵标本中细菌的检测和分型,不推荐常规用于细菌分离培养物的分型。PCR分型一般不用检测所有的血清群，应该根据流行的血清群或罕见的血清群的地理分布特征选择常见的血清群检测，一般应重点检测当地流行的血清群（型）。肺炎链球菌，Ct30，可用传统PCR方法，如果Ct值30，realtimePCR方法用于血清分型可提高敏感性。,菌种保存和运输,兔子血：抗生素少马血：含抗生素牛奶：含抗生素，需要专业级的奶粉配制菌种保存管：切勿反复冻融,52,预防策略,接种肺炎球菌疫苗是优选的预防方式降低肺炎球菌感染的严重危害抗生素的耐药性,WHO对多价肺炎球菌多糖疫苗推荐人群为2岁以上的肺炎球菌性疾病高危人群，包括：65岁以上健康老年人，尤其是在公共机构中生活的老年人慢性呼吸系统疾病、糖尿病、肾病综合征和某种免疫功能缺陷的患者，尤其是功能性或解剖学上无脾者,“由于肺炎球菌疾病在儿童和成人中的高负担，WHO优先考虑在发达和发展中国家进行肺炎球菌疾病的预防”,*WHOPositionPaperon23-valentpneumococcalpolysaccharidevaccine.WklyEpidemiolRec2008;83(Oct7):373-84./wer/2008/wer8342.pdf,53,已经颁布肺炎球菌免疫接种指南的机构,世界卫生组织(国际性的)-WHO免疫接种咨询委员会(美国)-ACIP加拿大医学会英国卫生部国家卫生与医学研究委员会（澳大利亚）中华医学会呼吸分会,数据来自：世界卫生组织，WeeklyEpidemiologicalRecord.2003;78(14):97-120;疾病预防和控制中心，MMWR.1997;46(RR-08):124;国家疫苗接种谘询委员会，加拿大2002疫苗接种指南;英国卫生部，2005年老年人和高危群体的肺炎球菌疫苗接踵程序;澳大利亚国家卫生与医学研究委员会，TheAustralianImmunisationHandbook,8thEdition,2003.,全球已有20多个国家的卫生机构推荐使用肺炎球菌多糖疫苗,54,肺炎球菌疫苗发展史,1911,1945,1976,1983,2000,2009,2010,Wholecellvaccine,4-valentPPV,6-,12-,14-ValentPPV,Merck:23-valentPPV,PPV,PCV,Wyeth:PCV7,GSK:PCV10,Pfizer:PCV13,WrightAE,etal.Lancet.1914;1:1-10,87-95.MacLeodCM,etal.JExpMed.1945;82:445-465.CDC.MMWR.1981;30:410-412,417-419.AustrianR,etal.TransAssocAmPhysicians.1976;89:184-194.Hillemanetal.BullWHO.1978,55,目前市场上的肺炎球菌疫苗,肺炎球菌多糖疫苗(PPV)：用于2岁Pneumovax23:默克/默沙东Pneumo23：赛诺菲-巴斯德惠益康(23价)：成都生物研究所肺炎球菌结合疫苗(PCV)：用于5岁Prevenar：辉瑞-惠氏Prevenar13：辉瑞-惠氏Synflorix：葛兰素史克,56,全球5岁以下儿童IPD病例肺炎球菌主要血清型分布,611个血清型引起70%的IPD病例。,1,5,6A,6B,14,19F,23F,HopeL.Johnson，PlosMedicine，2010,57,IPD病例肺炎球菌血清型构成具有地域性差异,HausdorffWPetal.CID,2000,亚洲儿童IPD病例,欧洲儿童和成人IPD病例,58,59,新的突破：疫苗预防,7价肺炎球菌结合疫苗(PCV-7)2000年首先在美国上市第一个也是目前唯一上市可用于2岁以下儿童肺炎球菌疾病预防的疫苗,60,PCV-7：儿童肺炎球菌疾病发病率显著下降,98%,CDC.MMWR.2008;57(06):144-148,上市前,上市后,24,61,纽莫法（23价肺炎球菌多糖疫苗),良好的耐受性及安全性全球使用超过25年，中国1996年上市，至今已有15年使用经验全球使用量达1.3亿针次以上FDA唯一批准在美国使用的23价肺炎球菌多糖疫苗,62,目前国内的产品,优博（巴斯德）（价格286/支）惠益康（成都所）（价格216/支）纽莫法（默沙东）（价格279/支）,63,纽莫法（23价肺炎球菌多糖疫苗),64,中国卫生部社区卫生服务协会推荐,什么样的人要打疫苗？建议：217周岁的青少年儿童；65岁以上的老年人要求并督促：高危人群慢性阻塞性肺病慢性心功能衰竭慢性肾功能不全糖尿病肿瘤或长期服用激素及免疫抑制剂者脾切除术后患者居住在老人院者,65,纽莫法的保护功效,66,瑞典的一项研究（1）,斯德哥尔摩65岁老人共26.0万参加研究全科医师完成了23价肺炎链球菌多糖疫苗和流感疫苗的接种3年研究的主要终点：比较两组人群住院率因流感、全部肺炎、肺炎球菌性肺炎和侵袭性肺炎球菌性疾病所致病死率,Lancet.2001Mar31;357(9261):1008-11.,67,瑞典的一项研究（2）,结果10.0万人(占目标人群的39%)接种了疫苗7.6万人接种了两种疫苗2.3万人只接种了流感疫苗841人只接种了肺炎疫苗接种人群的住院率低于非接种人群接种人群的肺炎发生率要比非接种人群低69%接种者的病死率都显著低于未接种者,Lancet.2001Mar31;357(9261):1008-11.,68,纽莫法能降低下呼吸道感染的程度,对全体受试者、COPD、冠心病、高血压患者的亚组分析，疫苗组下呼吸道感染的程度均有降低,69,住院时间比较,试验组平均住院时间20.005.66天对照组24.197.24天P=0.047,70,纽莫法（23价肺炎球菌多糖疫苗),有效预防肺炎球菌疾病含有23种肺炎球菌荚膜的血清型可以保护90%的肺炎球菌疾病,71,纽莫法使用剂量和用法,单剂量纽莫法0.5毫升肌肉注射纽莫法可在任何时间接种，无时间和季节的依赖性纽莫法可与流感疫苗同时接种，有叠加效果（用不同针管，在不同部位接种）,72,纽莫法（23价肺炎球菌多糖疫苗),接种后抗体在2至3周