番茄叶片蜡质和角质层与芝麻斑病菌侵染的关系

中国蔬菜 2010（18） ：47-50 CHINA VEGETABLES 番茄叶片蜡质和角质层与芝麻斑病菌侵染 的关系 康立功 齐凤坤 许向阳 李景富康立功 齐凤坤 许向阳 李景富 * * （东北农业大学园艺学院番茄研究所，黑龙江哈尔滨 150030） 摘 要：对 4 个抗芝麻斑病和 6 个感病番茄品种的叶片表皮抗性机制进行了研究。结果表明，采用氯 仿去除叶片蜡质，用 KOH 或角质酶去除叶片角质层后，叶片芝麻斑病发病率显著增加；叶片蜡质和角质层 同时去除的与叶片破损的芝麻斑病发病率差异不显著，表明叶片的抗性成分主要是蜡质和角质层。叶片蜡 质含量测定结果表明，蜡质含量和角质层的厚度与品种的抗性有关。抗病品种叶片蜡质含量显著高于感 病品种。叶片蜡质提取物在体外抑菌效果不显著，说明蜡质的抗性作用主要是物理性阻止芝麻斑病菌的 穿透。 关键词：番茄；芝麻斑病菌；叶片；蜡质；角质层 中图分类号：S436.412.1 +9 文献标识码：A 文章编号：1000-6346（2010）18-0047-04 Relationship between Tomato Leaf Wax and Cutin Layers with Infection by Helminthosporium carposaprum KANG Li-gong, QI Feng-kun, XU Xiang-yang, LI Jing-fu * （Tomato Research Laboratory of Horticulture Department, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China） Abstract：After the wax in tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）leaves was removed by chloroform, and the cutin layer was removed by KOH or cutinase, the fungal infection rate in tomato leaves was significantly increased. There was no significant difference in Helminthosporium carposaprum infection rate between leaves, whose wax and cutin were removed at the same time, and the leaves damaged by pin puncturing. This indicated that the major anti-disease components in leaves were wax and cutin. The result of testing wax content in leaves indicated that wax content and thickness of cutin layer had relation with variety resistance. The wax content of resistant variety was significantly higher than susceptible variety. Wax extract in leaves antibacterial effect was not significant in vitro. Wax resistance role was mainly to prevent physical penetration of Helminthosporium carposaprum. Key words：Tomato; Helminthosporium carposaprum; Leaf; Wax; Cutin layers 番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）芝麻斑病病原菌（Helminthosporium carposaprum）为半 知菌亚门番茄长孺孢属真菌。番茄芝麻斑病流行时，植株上、下部叶片同时发病。叶片上出现 2 收稿日期：2009-12-29；接受日期：2010-03-30 基金项目：国家科技支撑计划项目（2006BAD01A7-3-02） ，黑龙江省科技创新团队项目 作者简介：康立功，男，专业方向：蔬菜抗病育种，E-mail：kangligong * 通讯作者（Corresponding author） ：李景富，教授，博士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：lijf_2005 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 48 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2010 年 9 月（下） 5 mm 的灰褐色近圆形小病斑，病斑沿叶脉逐渐扩展呈不规则形，后期干枯不穿孔，叶片逐渐枯 死，造成果实不能膨大，成熟时果实变黄红色，缺乏光泽。开花前发病引起落花，不能坐果；挂 果后花萼发病不引起落果，但造成果蒂干枯。茎部发病多在叶片发病重的地方出现 3 mm 左右灰 褐色近圆凹陷病斑，并逐渐干枯，造成植株不能正常生长（徐东 等，2008）。植物的叶表皮位于 表皮细胞的外面，由沉积的角质层和蜡质组成（Juniper & Jeffree，1983）。角质层由最外层的上 表皮蜡质层和角质膜层组成，上表皮蜡质层主要由可溶性脂肪酸、烷烃、脂肪醇、酮类和酯类组 成，作为连续的无定形层位于叶片的最表面。角质膜层主要由羟基脂肪酸聚合形成的不可溶性多 聚酯组成。角质层的重要功能是降低植物表面的水分散失，此外，角质层还在防止紫外线辐射伤 害、抵御病虫害的侵染方面起重要作用（向建华 等，2005）。 本试验主要通过比较番茄叶片在人工针刺接菌破损前后，蜡质和角质层去除前后番茄叶片芝 麻斑病发病率的变化情况，探讨番茄叶片表皮的抗性机制；通过表皮蜡质含量的测定、去除蜡质 和角质层试验及蜡质体外抑菌试验，探讨抗芝麻斑病菌侵染番茄品种固有的抗性机制，为选育抗 性品种提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试菌株和番茄品种 供试菌株来自东北农业大学番茄研究所。 供试番茄品种：4 个抗芝麻斑病菌侵染的番茄品种为 08HN31、7943、7945、08HN30，6 个 感芝麻斑病番茄品种为 7920、7921、7942、7941、7944、7948，均由东北农业大学番茄研究所 提供。 接菌时用无菌水收集培养 78 d 的孢子，10 000 rmin -1离心 5 min，无菌水重悬，并调整孢 子液浓度为 110 6个mL-1。 1.2 试验方法 1.2.1 叶片直接接菌 选用健康、饱满的种子播于花盆中，置于人工气候培养室内。当幼苗第 3 片真叶展开时，采用喷雾法进行接种，然后将幼苗置于保湿箱中保湿 12 h，再移入培养室内继续 培育，每处理 30 株，3 次重复。第 3 天统计发病率。 1.2.2 叶片针刺接菌 播种方法同 1.2.1。当幼苗第 3 片真叶展开时，采用 1 mm 针头将叶片刺破 后，采用喷雾法进行接种，然后将幼苗置于保湿箱中保湿 12 h，再移入培养室内继续培育，每处 理 30 株，3 次重复。第 3 天统计发病率。 1.2.3 叶片蜡质含量的测定 参照 Russin 等（1997）的方法，播种方法同 1.2.1。当幼苗第 3 片真 叶展开时，每个品种取叶片 1 g，然后在氯仿中浸泡 60 s，取出叶片，氯仿蒸发后测定叶片蜡质的 残留量，并据此推算每个品种叶片的蜡质含量。 1.2.4 叶片蜡质体外抑菌鉴定 按 Russin 等（1997）方法，每个品种取 1 g 叶片浸泡在氯仿中 60 s，取出叶片，氯仿蒸干后，残留的蜡质用 3 mL 氯仿再溶，加入已配制好的 PDA 培养基中，并调 整每品种蜡质含量为 1 mgmL -1，倒入培养皿中，在无菌箱中放置 2 h，让氯仿挥发。在培养皿中 心加入 10 L 芝麻斑菌孢子液（110 6个mL-1。），置于 28 培养箱中培养，3 d 后测量芝麻 斑菌菌落的直径。以不加氯仿的 PDA 培养基为对照，3 次重复。 1.2.5 叶片角质层和蜡质抗芝麻斑病菌侵染的测定 参照 Guo 等（1995）的方法，叶片在 0.1 molL -1 KOH 溶液中浸泡 30 min 去除角质层后，蒸馏水冲洗 3 次，3540 风干。参照 Russin 等（1997）的方法，叶片在氯仿中浸泡 60 s 去除蜡质，待氯仿挥发后，1/3 直接接种；1/3 在 0.1 molL -1 KOH 溶液中浸泡 30 min 去除角质层，蒸馏水冲洗 3 次，3540 风干；1/3 在室温下 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 2010（18） 康立功等：番茄叶片蜡质和角质层与芝麻斑病菌侵染的关系 49 用角质酶处理 2 h，蒸馏水冲洗 3 次，3540 风干。统计各处理叶片发病率。 1.3 数据统计方法 试验数据采用 SPSS 软件进行方差分析。 2 结果与分析 2.1 叶片蜡质含量与蜡质提取物 抗-感品种叶片蜡质含量存在显著差异。 所有抗性品种叶片蜡质含量均比感病品种高， 而且差异达显著水平。 其中以08HN31叶片蜡 质含量最高，达 32.59 mgg -1（表 1）。 由表 1 可见，芝麻斑病菌在含有不同品种 叶片蜡质提取物的培养基上产生的菌落直径大 小有一定差异，但经方差分析，品种之间、品 种与对照之间的差异均不显著。表明番茄叶片 蜡质提取物对抑制芝麻斑病菌的生长并不明 显，且抗-感品种间差异不显著。 2.2 去除蜡质或角质层对叶片番茄芝麻斑病 发病率的影响 采用 1 mm 针头将叶片刺破后，所有品种叶片芝麻斑病发病率均显著增加，表明叶片蜡质层 和角质层是抗芝麻斑病菌侵染的重要屏障。 用氯仿去除叶片的蜡质后，所有参试品种芝麻斑病发病率显著增加，这表明去除蜡质能显著 提高叶片的发病率。抗性品种发病率平均增加了 29 个百分点；而感病品种发病率增加了 13 个百 分点，这表明抗性品种叶片的蜡质在抗芝麻斑病菌侵染方面的作用较感病品种要大。用 KOH 处 理去角质层后，抗性品种发病率平均增加了 46 个百分点，比去蜡质处理平均高 17 个百分点，而 感病品种发病率增加了 17 个百分点， 比去蜡质处理平均高 3 个百分点， 表明角质层在叶片抗性中 发挥的作用比蜡质大。如同时去除蜡质和角质层，即用氯仿处理去蜡质后，再用 KOH 或角质酶 处理去角质层，叶片芝麻斑病发病率显著增加。用氯仿+KOH 处理和用氯仿+角质酶处理的效果差 异不大。感病品种去除蜡质和角质层处理后芝麻斑病发病率与叶片破损处理的差异不大；而抗性 品种的差异达显著水平，表明抗性品种除叶片表皮外还存在其他的抗性机制。 表 2 氯仿、KOH、角质酶处理后番茄叶片发病率变化 发病率/% 品种 完整叶片 氯仿 KOH 氯仿+KOH 氯仿+角质酶 叶片破损 08HN31 16.7 a 36.7 b 56.7 c 70.0 d 66.7 d 80.0 e 7943 13.3 a 40.0 b 60.0 c 66.7 d 70.0 d 76.7 e 7945 13.3 a 46.7 b 56.7 c 76.7 d 80.0 d 86.7 e 08HN30 6.7 a 43.3 b 60.0 c 73.3 d 73.3 d 83.3 e 7920 80.0 a 100.0 b 100.0 b 100.0 b 100.0 b 100.0 b 7921 80.0 a 93.3 b 100.0 b 100.0 b 100.0 b 100.0 b 7942 83.3 a 90.0 b 96.7 b 100.0 c 100.0 c 100.0 c 7941 73.3 a 86.7 b 86.7 b 96.7 c 100.0 c 93.3 c 7944 80.0 a 90.0 b 100.0 b 96.7 b 100.0 b 100.0 b 7948 76.7 a 93.3 b 90.0 b 96.7 c 100.0 c 100.0 c 注：表中同行数据后不同小写字母表示差异显著（=0.05） 。 表 1 番茄叶片蜡质对体外抑菌的影响 品种 蜡质含量/mgg -1 菌落直径/cm 08HN31 32.59 a 1.26 a 7943 31.95 a 1.22 a 7945 30.66 a 0.98 a 08HN30 29.95 a 1.26 a 7920 25.46 b 1.12 a 7921 25.28 b 1.16 a 7942 24.82 b 1.21 a 7941 24.25 b 1.26 a 7944 23.96 b 1.17 a 7948 23.84 b 0.98 a 对照 1.26 a 注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著（=0.05） 。 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 50 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2010 年 9 月（下） 3 结论与讨论 叶片表皮蜡质层是植物与环境分离的界面，真菌在叶片表面粘附与定殖时首先接触到的是蜡 质层，然后孢子萌发产生萌发管，这些过程的完成常常需要湿润的环境。Johnstone 和 Bailey （1985）发现苹果品种的叶片和果实上的蜡粉层可以迅速排除水滴从而抵抗苹果黑星病菌的侵 染；Jensen 和 Driscoll（1982）也注意到田间生长的植物中有蜡质层的品种比没有蜡质层的品种发 病轻；陈志谊（1996）对水稻纹枯病的研究结果表明，抗病品种的叶片蜡质含量明显多于感病品 种。Alcerito 等（2002）认为蜡质层中存在抗真菌物质，并从二叶腾属短梗稠李（Arrabidaea brachypoda）叶的表皮蜡质中分离出 4 种黄酮类抗真菌成分。番茄叶片表皮中的成分棕榈酸 （9-hexadecanoic acid）能抑制白粉病菌 Erysiphe polygoni 孢子的萌发（Wang et al.，2000）。Wang 等（2006）报道了植物叶表皮蜡质成分的不同，与叶面入侵型病原真菌分泌的酯酶存在着对应关 系，寄主的蜡质能诱导病原真菌分泌更多的胞外酯酶，且能被该酯酶降解较为彻底；而非寄主的 蜡质诱导病原菌分泌的酯酶较少，且不易被降解，认为在某些植物与病原菌互作中，植物叶表皮 蜡质与潜在病原真菌胞外酯酶的对应关系，对病原真菌选择性入侵寄主具有重要作用。有些真菌 可直接从气孔入侵，但更多的真菌入侵时需要产生入侵结构附着胞等，入侵结构附着胞的形成也 受蜡质层的影响（Rubiales & Niks，1996）。 本试验表明番茄叶片在芝麻斑病菌侵染中发挥机械性阻碍作用，而起作用的主要成分是叶片 的蜡质和角质层。 品种抗芝麻斑病菌侵染能力与叶片表面所覆盖的蜡质的多少、 角质层厚度有关。 叶片表面蜡质和角质层厚度可作为番茄抗芝麻斑病菌育种的辅助标记之一。 参考文献 陈志谊1996水稻纹枯病抗性机制的研究中国农业科学，25（4） ：41-46. 徐东，宋志业，赵永超，赵千里，刘永2008番茄芝麻斑病的发生规律与综合防治吉林蔬菜， （1） ：42-43. 向建华，陈信波，周小云2005植物角质层蜡质基因的研究进展生物技术通讯，16（2） ：224-227. 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