BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(2): 368372 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw 本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08002-001)资助。 * 通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy, Tel:* 同等贡献(Contributed equally to the work) Received(收稿日期): 2012-07-16; Accepted(接受日期): 2012-10-09; Published online(网络出版日期): 2012-12-11. URL: DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00368 BvGLP1 过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性 党 良 1,2,* 宿振起3,* 叶兴国2 徐惠君2 李 钊2 邵艳军1,* 张增艳 2,* 1 河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081; 3河北省农林科学院粮油作物研究所, 河北石家庄 050035 摘 要: 类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有 cupins 结构域的糖蛋白, 在植物基础抗性等方面起着重 要作用。本研究人工合成了甜菜 GLP 基因 BvGLP1, 并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子 RSS1P 驱 动的 BvGLP1 基因单子叶植物表达载体 pA20-RSS1P:BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦 18 中, 对 转基因扬麦 18 的 T0至 T3代植株中 BvGLP1 进行了 PCR、半定量 RT-PCR 和荧光定量 QPCR 检测, 并对转基因小麦 进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明, BvGLP1 已转入转基因小麦扬麦 18, 并能在转基因小麦中遗传、转录表达; 5 个转 BvGLP1 基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦 18 有显著提高, 说明 BvGLP1 过表达增强了转基因小麦 对根腐病的抗性。 关键词: 类萌发素蛋白; BvGLP1; 转基因小麦; 小麦根腐病; 抗性 Expression of BvGLP1 in Transgenic Wheat Enhances Resistance to Common Root Rot DANG Liang1,2,*, SU Zhen-Qi3,*, YE Xing-Guo2, XU Hui-Jun2, LI Zhao2, SHAO Yan-Jun1,*, and ZHANG Zeng-Yan2,* 1 College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Institute of Grain and Oil Crops, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050035, China Abstract: BvGLP1 is a kind of germin-like protein (GLP) from sugar beet. GLP catalyzes the oxidation of oxalic acid to produce hydrogen peroxide that induces plant defense response to pathogen and results in enhanced-resistance. The open-reading-frame sequence of BvGLP1 was synthesized and used to construct a BvGLP1 expression vector pA20-RSS1P:BvGLP1. In the vector, the expression of BvGLP1 was controlled by rice sucrose synthase-1 promoter (RSS1P). BvGLP1 was introduced into wheat vari- ety Yangmai 18 through bombardment. The presence and expression of BvGLP1 in T0 to T3 transgenic wheat plants were charac- terized by PCR, RT-PCR, and QPCR analyses. The common root rot and sharp eyespot disease tests on BvGLP1 transgenic wheat plants following artificial inoculation with the pathogens revealed that the expression of BvGLP1 in five transgenic wheat lines significantly enhanced resistance to common root rot. Keywords: Germin-like protein; BvGLP1; Transgenic wheat; Wheat common root rot; Resistance 近年来, 我国小麦土传真菌病害呈加重发生态势。 如 由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病1, 已成为我国小麦主产区的主要病害之一,一般地块减产 10%30%, 严重地块减产超过50% 2。由平脐蠕孢菌 Bipolaris sorokiniana (有性态为禾旋孢腔菌Cochliobolus sativus)等引起的小麦根腐病, 发生于世界各国, 在我国 以北方麦区尤为严重, 一般减产5%10%, 严重地块减产 20%50%3。小麦对这2种病害的抗性均由多基因控制, 因而通过常规育种提高对2种病害的抗性进展缓慢。研究 小麦的抗病机制可为小麦抗病育种提供理论依据和有效 新途径。 类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有 第 2 期 党 良等: BvGLP1 过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性 369 cupins 结构域的糖蛋白, 在植物发育、逆境反应和寄主基 础抗性反应中具重要作用4-5。萌发素与类萌发素蛋白最 早发现于小麦中, 作为胚萌发起始的特异标记6。GLP 编 码基因在不同的发育和生长条件下及不同植物组织中表 达模式不同, 一些 GLP 基因受病原真菌诱导7-8。一些 GLP 具有草酸盐氧化酶(oxalate oxidase, OXO)或超氧化 物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 能催化草酸 氧化, 产生二氧化碳和过氧化氢, 过氧化氢促使植物细胞壁 初生壁中木聚糖交联, 使细胞壁更为致密和坚固9-11。GLP 还可作为一种信号分子, 直接或间接诱导防御反应12-13。 植物在对活体营养型病原的防御反应中会产生水杨酸, 后者在植物体内与过氧化氢酶结合、 抑制过其活性, 使植 物内 GLP 氧化草酸产生的过氧化氢迅速增加, 过氧化氢 能够诱导防御基因表达, 从而使植物产生抗病性14-15。 GLP 基因异源表达的转基因植物为 GLP 防御功能提供了 直接证据, 如一个小麦 GLP (gf-2.8)具有 OXO 活性, 转 gf-2.8 基因的大豆、烟草、向日葵、油菜对核盘菌的抗性 增强16-17。 表达小麦 gf-2.8 的转基因杨树和玉米提高了对 壳针孢菌18和欧洲玉米螟19的抗性。另外, 具有 SOD 活 性的大麦 GLP (HvGER5a)可增强植物抗病性20。BvGLP1 是从抗根结线虫甜菜中分离的 1 种 GLP 基因, BvGLP1 的 异源超量表达显著提高了转 BvGLP1 基因拟南芥对轮枝 孢菌和立枯丝核菌的抗性4。 然而, BvGLP1 基因在小麦抗 根腐病、纹枯病基因工程应用潜力的研究还未见报道。 本研究构建了甜菜 BvGLP1 基因的高效植物表达载 体, 通过基因枪介导方法转入小麦品种扬麦 18中, 并对 转基因小麦 T0至 T3代植株进行分子检测和抗病性鉴定, 以明确 BvGLP1 在基因工程培育抗病小麦中的应用潜力。 1 材料与方法 1.1 BvGLP1 基因的植物表达载体构建 根据 NCBI 已公布的 BvGLP1 基因全长序列, 人工合 成其全长读码框(open reading frame, ORF), 共 636 bp, 合 成时在基因的 5端和 3端分别添加 BamH I 和 Sac I 酶切 位点, 合计 646 bp。如图 1 所示, 用 BamH I 和 Sac I 双酶 切含上述基因和 pAHC20-RSS1P:TiERF1 载体21, 回收 所需片段, 利用 T4 连接酶连接。构建成 BvGLP1 基因 的植物表达载体 pA20-RSS1P:BvGLP1 (图 1), 转化到大 图 1 转 BvGLP1 基因表达载体 pA20-RSS1P:BvGLP1 的构建示意图 Fig. 1 Construct scheme of the BvGLP1 transformation vector pA20-RSS1P:BvGLP1 370 作 物 学 报 第 39 卷 肠杆菌 TOP10 感受态细胞中, 进行菌落 PCR 筛选、测序 分析, 以确定该转基因表达载体构建是否成功。 该载体中 BvGLP1 基因表达受韧皮部特异表达启动子 Rss1P 控制, 后者可以驱动目标基因在单子叶植物根、 茎、 叶中高效表 达21。 1.2 转 BvGLP1 基因小麦的获得 转基因受体为小麦推广品种扬麦 18 (江苏里下河农 业科学研究所程顺和提供)。应用基因枪介导法22, 将 pA20-RSS1P:BvGLP1 表达载体与带 bar 基因的 pAHC20 质粒 DNA 按 1 : 1 比例混合, 再和适量的金粉混合后, 转 化小麦品种扬麦 18 幼胚愈伤组织, 通过筛选、分化、再 生等步骤, 最后将再生植株移栽至花盆中, 于中国农业 科学院作物科学研究所(北京)的网室和温室内继续生长 至成熟。 自 T0代至 T2代, 均从成活的转 BvGLP1基因 PCR 呈阳性的植株上收获种子, 单株播种, 获得下一代植株 后进行分子检测和抗病性鉴定。 1.3 外源 BvGLP1 基因的 PCR 检测 根据转基因载体 pA20-RSS1P:BvGLP1 的序列, 设 计转基因检测特异引物 GLP-TU (5-ATAGTTGCTGGT TTTATCGA-3, 位于 BvGLP1 ORF 序列上)和 Tnos-L (5-ATCGGGAATTCAAGCTTGCA-3, 位于 TNOS 终止 序列上)。 提取转 BvGLP1 基因小麦 T0至 T3代植株的叶片 基因组 DNA 进行 PCR 扩增, 扩增条件为 94预变性 3 min, 94 45 s, 51 45 s, 72 45 s, 35 个循环, 72延伸 5 min。使用含 EB 的 1.8%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。 预期扩增片段 476 bp。 1.4 外源 BvGLP1 基因的转录水平 小麦接根腐病菌30 d后, 取0.1 g叶片, 利用TRIZOL 试剂(Invitrogen)提取总 RNA, 使用 RNA PCR Kit Ver.3.0 cDNA 合成试剂盒(TaKaRa) 合成第一链 cDNA。以第一 链 cDNA 为模板, 用 Actin 基因特异引物(ACT-A: 5-CAC TGGAATGGTCAAGGCTG-3; ACT-B: 5-CTCCATGTCAT CCCAGTTG-3)对各样本扩增, 使各样本 cDNA 模板量均 一化。然后用 BvGLP1 基因的特异引物(BVGLP-QU: 5-TTCCCAGTTGGACCAGCCG-3; BVGLP-QL: 5-TAG ACCGTTCAAGGCAGGGA-3)进行半定量 RT-PCR 分析。 扩增条件为 94预变性 3 min; 然后 94 30 s, 50 30 s, 72 30 s, 共35个循环; 最后72延伸5 min。 按照SYBR Premix ExTaq (TaKaRa)反应系统, 在 ABI PRISMR 7300 实时荧光定量 PCR 仪上进行实时荧光定量 RT-PCR (Q-RT-PCR)分析。反应体系 25 L, 反应条件为 94预 变性 1 min; 94变性 15 s, 60退火 31 s, 45 个循环。每 个反应均有 3 次生物学重复。以转基因扬麦 18 为对照, 用 2CT方法23计算转基因小麦中 BvGLP1 的相对表达 量。 1.5 根腐病和纹枯病抗性鉴定 按 Dong 等24报道的菌麦粒和牙签接种法进行小麦 根腐病抗性鉴定, 在小麦分蘖盛期用牙签加麦粒接种平 脐蠕孢菌菌丝, 于蜡熟期进行抗病调查, 按 04 级划分病 级, 设未转基因的扬麦 18 为对照。 参考蔡士宾等25报道的牙签菌接种法进行纹枯病抗 性鉴定, 在小麦分蘖盛期用消毒镊子夹取长满禾谷丝核 菌 R0301 菌丝的牙签段, 轻轻地嵌入麦苗叶鞘内, 保湿 35 d, 于收获期采用 05 级分级方法25调查小麦纹枯病 发病程度。 2 结果与分析 2.1 转基因载体的构建与转基因植株的 PCR 检测 测序结果表明基因转化载体 pA20-RSS1P:BvGLP1 构建的方向和基因序列是正确的。利用基因枪将 pA20- RSS1P:BvGLP1轰击扬麦 18 的幼胚愈伤组织 1320 块, 经 筛选、分化, 获得再生植株 67 株, 通过 PCR 检测出 T0 代阳性植株 18 株, 转化率为 1.46%。 利用 BvGLP1 基因转化载体序列的特异 PCR 引物, 在每代材料中均检测到转 BvGLP1 基因(476 bp), 其中抗 根腐病的转基因小麦 5 个株系的 T3代 50 个单株的 PCR 检测均为阳性(图 2), 表明转入的 BvGLP1 基因可在这些 株系中遗传, 在 T3代近于纯合。 2.2 转基因植株中 BvGLP1 基因转录水平 半定量 RT-PCR 分析结果表明, T2代抗根腐病的转基 因扬麦 18 株系 T1008、T1010、T1023、T1037、T1038 中 BvGLP1 基因的转录表达水平均高于未转基因的扬麦 图 2 转 BvGLP1 基因小麦 T3代植株的 PCR 检测 Fig. 2 PCR analyses on BvGLP1 of the transgenic wheat in T3 generation M: D2000 DNA marker; CK: 蒸馏水; P: 转基因载体质粒 pA20-RSS1P:BvGLP1; WT: 未转基因扬麦 18; 1: 转基因株系 T1008; 2: 转基因株系 T1010; 3: 转基因株系 T1023; 4: 转基因株系 T1037; 5: 转基因株系 T1038。 M: D2000 DNA marker; CK: ddH2O; P: BvGLP1 transformed vector plasmid pA20-RSS1P:BvGLP1; WT: wild-type Yangmai 18; 1: transgenic line T1008; 2: transgenic line T1010; 3: transgenic line T1023; 4: transgenic line T1037; 5: transgenic line T1038. 第 2 期 党 良等: BvGLP1 过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性 371 图 3 转 BvGLP1 基因株系中 BvGLP1 基因表达的 RT-PCR(A)和定 量 RT-PCR(B)分析 Fig. 3 RT-PCR (A) and Q-RT-PCR (B) assays on BvGLP1 tran- script in transgenic wheat plants WT 为未转基因的扬麦 18, 其他为各转基因株系, a, b, c, d: 各株系 在 P 0.05 水平相互之间差异显著。 WT is the wild-type Yangmai 18, and others are the BvGLP1 transgenic lines, a, b, c, d: signifi cantly different from each other at P 0.05. 18。进一步利用 Q-RT-PCR 定量分析上述株系中 BvGLP1 基因表达量, 这 5 个株系中 BvGLP1 转录水平显著高于未 转基因扬麦 18, 不同植株中的表达量也存在一定差异 (图 3)。 2.3 转基因小麦的根腐病与纹枯病抗性 鉴定 28 个株系 T2代转 BvGLP1 基因扬麦 18 的 560 株单株的根腐病抗性, 收获后继续鉴定 10 个株系 T3代 转 BvGLP1基因扬麦 18的 104株单株的根腐病抗性, 同 时种植未转基因的扬麦 18 作为对照。最终发现 5 个转 BvGLP1 基因株系(T1008、 T1010、 T1023、 T1037、 T1038) 的根腐病抗性显著提高, 且能够稳定遗传(表 1)。对 T1 代植株进行纹枯病抗性鉴定, 但未发现抗病性显著提 高(表 1)。 3 讨论 研究证明, 一些植物 GLP 基因具有一定的防御作 用4,16-20。转 BvGLP1 基因拟南芥中, BvGLP1 基因组成 型的超量表达提高了过氧化氢的含量, 激活了防卫基 因 PR-1、PR-2、PR-4 和 PDF1.2 的表达, 进而增强了转 基因植物对轮枝孢菌和立枯丝核菌等植物病原真菌的 抗性4。 表 1 转 BvGLP1 基因小麦株系根腐病和纹枯病抗病性鉴定 Table 1 Resistance to common root rot and sharp eyespot of BvGLP1 transgenic wheat lines 根腐病病情指数 Disease index of common root rot 转基因株系 Transgenic line T2代 T2 generation T3代 T3 generation 纹枯病病情指数 Disease index of sharp eyespot T1008 22.0* 20.0* 36.7 T1010 24.0* 24.0* 36.9 T1023 20.0* 22.0* 40.0 T1037 25.0* 26.6* 35.0 T1038 18.0* 18.0* 41.1 扬麦 18 Yangmai 18 45.5 48.0 40.9 扬麦 18 为未转基因对照, *表示转基因株系与对照有显著差异(P 0.05)。 Yangmai 18 is the host of the transgenic lines. * indicates significant difference between the transgenic line and the host variety (P 0.05) according to analysis of variance. 为了明确 BvGLP1 基因表达是否可以提高转基因小 麦对一些病原真菌的抗性, 本研究构建了 BvGLP1转基因 小麦载体, 利用基因枪将 BvGLP1基因转入小麦品种扬麦 18 中。对转 BvGLP1 基因小麦 T0代到 T3代植株的 PCR 检测和转录表达分析结果表明, BvGLP1 基因在转基因小 麦中可以遗传和超量表达。连续 3 代抗病性鉴定结果发 现, BvGLP1 的表达显著提高了转基因小麦对根腐病的抗 性, 可能是 BvGLP1 基因的超量表达及其激活的防卫基因, 增强了转 BvGLP1 基因小麦对根腐病菌的抗性; 然而, 与 受体小麦相比, 转 BvGLP1 基因小麦对纹枯病菌的抗性 没有显著提高。这从另一侧面说明, 小麦对根腐病菌的 抗性机制不完全相同于小麦对纹枯病菌的抗性机制。 References 1 Chen Y-X(陈延熙), Tang W-H(唐文华), Zhang D-H(张敦华), Jian X-Y(简小鹰). 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