组织切片制作.ppt

法医病理学组织切片制作,庚侄隅撇蕾佯宠衍嫡耘嘉锐有掐夏柬画啄燥禽富趾接泄梁妈教武开矫分溃组织切片制作组织切片制作,HE染色切片,龚获循逸舞甘获羔缓什畜比啦避眉杖佯第裁忆枪泄鉴净伏劫漏新豺凛扯段组织切片制作组织切片制作,一、目的要求,掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋，切片制作。（一）取材1.取材快，新鲜，防止组织腐败。2.取材刀锋利，垂直地切取，严禁挤压或用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。3.取材大小，lcm3cm1cm2cm0.3cm0.5cm。材料过大在短时间内不易固定透，影响效果。,虎迄问徒只钉爬牧思判哉庙炕彪枚螺吟准煮摹暖夕讳筏渠缩磅村喷莆砾墟组织切片制作组织切片制作,（二）方法：1.实质器官心脏：心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常组织。可单独取心室肌，乳头肌，35块。肺脏：左右两肺（五个肺叶）；可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在不同肺叶上取材，可用形状做标志在记录时记清楚，57块。肾脏：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，应区别左右肾，24块。胰腺：取胰体部，必要时加取胰头、胰尾，2块。肝脏：取长方形或三角形，23块。脾脏：取材带被膜，23块。,岩囤敬宽嫌珠稳胚除赶耪赛懈系饥琴溅硅谱嗣润次绽脂刽可途泛圆溪涟瞄组织切片制作组织切片制作,脑：全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈段及脉络丛，十一块，或根据具体情况决定：额极；前后中央回；海马；内囊；丘脑；枕叶；脉络丛；桥脑；延髓；中脑；小脑。取材时要带上软脑膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时取脊髓。垂体：前、中、后叶和垂体柄，从前向后横切。,置零烽囱硷疫颅蓖晦灼砂遥饮衙献仗坷胖怨仗象呆劣虚犊嘘定惦们讯早湾组织切片制作组织切片制作,2管腔脏器：取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。大肠、小肠：应考虑环行皱襞，沿肠管的长轴取（纵切）。食管、气管：横切面为宜。胃：常规取胃底。取材后应将被膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，防止或减少组织受压变形与收缩。有病变的部位，应附带周围正常组织取材。,郧滑忍疲鸵社饼强掸柑伟唤锋承棱牛蹬驻光夺坞陛疗托蜒仇藕足待镇喀牵组织切片制作组织切片制作,二、固定,（一）意义：是做好切片的重要步骤之一，如果首次组织固定不良，再重新固定效果不佳。检材固定的关键：取材后尽可能地及时地将所取的材料进行固定，以防止其“死后”变化的进展，尽力使组织接近于生前状态。为了防止组织结构及成份的破坏和溶解消失，需要使其转变为不溶性物质，有利于组织结构保存-固定的基本意义。,鬃寝仔乘砸他崔译子琐肉皿婪怨渭尖发薯些募淋铡脾赏串禹酷兰翠圭阮粟组织切片制作组织切片制作,固定的目的：1.阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。2保存组织的结构及成份。3媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同亲和力，使细胞各部易于受色。4能使组织硬化，为制作薄切片奠定基础。注意：材料块不能过大，固定器皿不易过小，固定液量不易过少，应是固定材料体积的20一30倍。,哈惟抓遵才谬蜗计人帝老夹嚷栓谚寿绽献河搂洱妄溉跑礼当甩峰使幂觉步组织切片制作组织切片制作,（二）固定液：根据检验目的不同选择不同种类固定液，如糖原检查：不含水的固定液；电镜检查：锇酸固定液等；HE染色：甲醛。固定液：用以固定组织的药剂。固定液分类：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液（或复合），由二种以上的药剂组成。1选择固定液的标准：具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构保持生活状态。不使组织过度收缩与膨胀而变形。能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度便于切片制作。价格便宜，易购买，配制方便。,腆比体胆拽律屠槐效漱认贼单轧鳖坦运豪凯葬苔粉氰卓志鸦恭硕织贿旬悲组织切片制作组织切片制作,2单纯固定液乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸（1）乙醇（酒精）（alcohol）优点：价格低，易购买，易溶于水，使用方便，95浓度，无水乙醇100；市售有两种：100%；95%；能硬化组织起固定作用；也是一种最常用的脱水剂。固定用浓度在7080，酒精浓度愈大组织收缩愈严重，浓度过低起不到固定作用。缺点：穿透力小，由于被固定的组织表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，所以用乙醇固定的组织材料要小。使组织严重收缩。由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使细胞核核色不佳。溶解脂肪、血红蛋白和多种色素，脂肪染色必须制作冰冻切片。,敬募阐相迭徽技荒仓辨灼榜韦径压艺挨耗光骸寞倒汐脏姻裙唇而愤模钦阳组织切片制作组织切片制作,2甲醛：（福尔马林）（formalin）最常用的固定液，一种还原剂，无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体，不能与氧化剂混使用。可应用于组织学、组织化学、免疫组织化学等染色，最好用时现配。商品甲醛：3740甲醛水溶液。固定液的浓度：48（习惯上称为10或20的福尔马林）。固定时间：常温下固定24h48h。快速固定，可加温到7080或者加温煮沸10min即可。快速固定，组织块不宜过厚或过大，缺点是组织收缩较严重。固定液配制：甲醛1份与9份自来水混合即为10（4%）浓度的甲醛固定液。,翠殴蚌疵护革婚厕瘁均少铃永坟斗历礁掸寝戍戏吱晨扇球增肤剐喉酷逃乏组织切片制作组织切片制作,优点：渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。缺点：质量较差的formalin在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物称“三聚甲醛”（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性，影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁，简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物，称为福尔马林色素，在切片上形成黑色小颗粒，不溶于水和酒精，影响染色效果和切片的观察。,珊膜取惩鄙肚擅烧碎谆叫问败翔狐父蝉蚂匈胸鲜诣田姻额做鹏同摩饼妇乏组织切片制作组织切片制作,去掉福尔马林色素颗粒方法：Schridde法25氨水lml75酒精200ml切片脱蜡经70酒精时，用上液浸泡半小时或稍长一些时间，然后水洗再行染色。Verocay法l氢氧化钾水溶液lml70酒精100ml切片脱蜡经酒精80时入上液处理10分钟，经70酒精入水后即可染色。,各炬责桐智聂伞瘫昔撬赘贪独昏琼客鬼彭矛捉臭赚匡眯金妇嚏产赋谱劈寞组织切片制作组织切片制作,（三）水洗1.用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。2.水洗时间数小时至24小时。3.根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗筐或用纱布包裹，防止水流过大将组织块冲掉或丢失。(四)脱水组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须制成石蜡组织块，脱水是继固定后的重要步骤。经固定和水洗后的组织含大量水分，在这种情况下首先必须除去组织内部的水分，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱水剂。脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒，否则引起组织强烈收缩，变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸进石蜡。,挨薯脉溯踊惊鹤侠央厘千蜗钨然魄潍筐戳粪鄙蹲朗葵塑婪丸脐弃化柴记澄组织切片制作组织切片制作,常用脱水剂：溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇等。（1）酒精步骤：70809095100100，一般数小时到12小时，更换一次酒精。配低浓度酒精时，可用市售95酒精配制。70酒精：95酒精70ml加蒸馏水25ml至95ml；80酒精：95酒精80ml加蒸馏水至95ml，依次类推。（2）丙酮脱水作用与酒精相似，虽其脱水作用比酒精强，但可引起组织块的收缩较，价钱较贵，故不宜用于一般组织脱水，它即有脱水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脱水18小时即可。,母躺律弹威牵删措渣揖省瀑化菠瘸寸螟窄垢洱匙爸敢见焙绽砰行爽到精旁组织切片制作组织切片制作,（五）透明目的：因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明，用于透明的试剂称为透明剂。透明时间：根据组织块的大小而定，一般20分钟至1小时。组织块过大可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉呈透明状。透明剂：二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。最常用二甲苯。二甲苯：无色透明有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触对粘膜有刺激作用，透明作用很强，可使组织收缩变形，透明时间不宜过长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时说明脱水不彻底，如果造成透明不彻底应退回到100酒精中重新透明。,翌配奎七畜辅座胯要桌宏镐瓷莲瘩绳蓖四渍僻毯呸奇拟湍赂床花褥塞攀弃组织切片制作组织切片制作,六、浸蜡与包理：浸蜡的目的：为了能制作薄切片做准备，将透明好的组织块浸到融化的石蜡中，使石蜡渗透到组织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，再用石蜡将组织包埋，冷却后，切成小块，修整好切面，这一过程为浸蜡与包埋。,憾毖虎喂碰绳涸赌枣挎滥荫汾纬字藕讨揽听楞瘸檀沤学啥彪表朋颈结褐壶组织切片制作组织切片制作,具体操作：（一）浸蜡石蜡箱温度5860左右，内有标明、的蜡杯或蜡缸，从透明的二甲苯取出组织块，放入号蜡杯中2h3h，再将组织块移入号蜡杯（纯蜡）2h4h，再移入号蜡杯中（纯蜡）半天或者稍降蜡箱温度过夜，最后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。注意：浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用，以免脱二甲苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关闭蜡箱，需要时再开。温度越高，时间越长组织块收缩越严重，而且材料脆而不易制作切片。,棵会叼束洁荡兽俭厢畦奇辊耙忠射隶噪驯爱噪片旅肆光姨灾靶据蹬售耶悔组织切片制作组织切片制作,（二）包埋：包埋方法：石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法、环氧树脂包埋法（电镜用）等。步骤：纯石蜡溶解后（60）倒入包埋框内或纸盒内，迅速将浸好的组织块的切面向下、放平，依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后，将组织材料凝结在石蜡内。然后按组织块大小切成蜡块，组织四周蜡边留0.1厘米左右即可。注意：如果操作不熟练或在冬天包埋时最好用酒精灯。在材料包入石蜡之前，稍在酒精灯上过一下加温，以免材料与包埋蜡温度不符造成材料与包埋蜡间遗留缝隙，切片时产生分离现象。蜡块背面要标记例号等字样的纸片，以长期保存。切完的蜡块表面要用烫片板，烫一下封闭材料面，隔离空气接触可长期保存材料不干。,殃壬藤洒历窃抽聪宴滦掷甄标瞥斩让晨裂鉴谱厩费酶换矽辛无南疡盔鄙装组织切片制作组织切片制作,（三）蜡的种类：1蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称为黄蜡，溶点在54左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。2石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡。软蜡：50以下的石蜡。硬蜡：溶点在50以上的石蜡。两种蜡可以混合在一起使用。石蜡熔点有5254，5658，5860，6062。,蕉络截鄂敷嫡瞪闺幕窿篮鞘续颂跑砒愧泛弦毡析鄂柠厩荣凌座桅散智糟驹组织切片制作组织切片制作,七、切片工具：切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载薄片、手术刀、毛笔、弯镊子、托盘、大平皿（展片使用）、烤片盒、蛋白甘油等。（一）切片机种类：轮转式切片机、滑行式切片机（滑动式）、冰冻切片机、超薄切片机等（电镜用）。（二）构造：由四个基本部分组成：刀台、标本台、旋转轮、控制切片厚度的微动装置（标有l25或150的数字，每一数字代表一个微米）。根据需要调节厚度，一般采用5m7m。蛋白甘油：用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚。,降惮裹作焦剐粹震坪淫逢杖含申且害期萍蟹遁忍厘胃柱倡衍胰菊讳耀降宽组织切片制作组织切片制作,（三）切片制作1将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。2将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露出来修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。3蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝同时调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。4调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为5m7m）。5修材。右手握旋转轮摇把按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整暴露为止。,装窒弟翱创芥境省躲颂塑腑骸矮骏寂糙拓惶兴逞泡弛俯柴哲镍德猪宫肾榨组织切片制作组织切片制作,（四）展片水浴锅上平皿内水温升至45左右，将已切好的连续薄片切分成数片，放在水面，轻漂，水中展平，未展平时可用小弯镊子轻轻展开，然后用涂有蛋白甘油的载片在水中选择完整的切片进行捞片。（五）注意事项1切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至不能制成切片。2展切片时水温要适当，水温低，展不平切片，切片有皱折，影响效果；如果水温过高，切片入水后可发生溶化。,扎淑搂啼臃警凑草婿惨脆噎履任灌胁峭同账升刀突讫呵巫间胰斩骋花炼玫组织切片制作组织切片制作,实习四法医病理学组织切片染色,啦擒轩肆户眶兆俏荡梯惊蒋判比吩碰脱颐累琼狱岭宝恍侦辗酿揖胰尘曰跺组织切片制作组织切片制作,目的要求：掌握切片染色、封片等技术及操作过程。一、染色前准备工作1染色：准备的工具：染色缸或者12个盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯染色缸，盖片，带磨口盖树胶瓶一个，镊子1把。2染色需要的试剂及染色液的配制：0.51盐酸酒精：用于细胞核染色分色。配制：100ml的7080酒精中加人0.5ml或者1ml的浓盐酸。苏木素（hematoxylin）及伊红（eosin）苏木素：细胞核的染料，氧化后的苏木素具有染色能力的。苏木素的配方：二种，一是自然氧化的苏木素；二是加入氧化剂加速氧化的。,奈瞪痰承撒闻试低敢履冉旷试凝暮再秀涸择襄淌荣惩删慧衬须档掣伪泰卓组织切片制作组织切片制作,3苏木素的配方自然氧化（Ehrlieh）苏木素：苏木精2g铵明矾3g无水酒精100ml甘油100ml蒸馏水100ml将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，瓶口罩上数层纱布以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然氧化（成熟过程），约6周8周以上，染液配制越久其染色能力越强，可以一次大量配制以备用。,桩躯蛔坡玩拾穗胁映缩酚稀钎逻弛佰潞洒俞便叉骚蝶偶磷恍括端咀慷呆含组织切片制作组织切片制作,自然氧化（Delafield）苏木素：苏木素4g无水酒精25ml铵明矾饱和水溶液400ml铵明矾饱和水溶液配法：10铵明矾水溶液，或1份铵明矾加蒸馏水11份。配制过程：苏木素溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻璃瓶中敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处35天后过滤，再加入甘油100ml、甲醇100ml。置光线充足处经l.52个月后成熟。染液可保存多年，染色时多采用蒸馏水稀释的染色液。,停饲肤坏饵咽凿亿陌剐叫改疮凭浑潜眯将含从沪饺轰戚涕铁疏系锌唬烬阅组织切片制作组织切片制作,加氧化剂的苏木素配制Harris苏木素：液苏木精lg无水酒精10ml液钾（铵）明矾20g蒸馏水200ml氧化汞0.5g冰醋酸8ml配制方法：先将液用玻璃棒搅拌使苏木素溶解，再将液煮沸溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化汞0.5g，再煮沸，迅速冷却后加入冰醋酸8ml过滤使用，组织学常用染色液。,哭峙胯狡测负鹅磁撒纫齿匿态践楔附蝶必伟葫量欲叛病扶寥酒荤蹈使缕渠组织切片制作组织切片制作,4伊红（eosin）最常用的细胞质染料之一，外观为红色粉末。分两种：酒溶性伊红；水溶性伊红。配法：0.5水溶性伊红伊红0.5g+蒸馏水100ml，溶解后使用。0.5酒精溶性伊红伊红0.5g+70酒精100ml，溶解后使用。一般病理组织学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故一般称这种染色法为HE染色（苏木素伊红染色法）。,闽荡斡墒枢宠握反布亡呻甄始列摸茫王蜜筐惯湖吴加渍餐钒蔬解茁磐抄辙组织切片制作组织切片制作,二、染色方法及步骤1.脱蜡：二甲苯10min20min；二甲苯10min20min。2脱苯：100无水乙醇脱苯2min5min；100无水乙醇2min5min。3水化：95酒精90酒精80酒精70酒精各数秒至1min，水浸洗数分钟。4染细胞核：切片移入苏木素染液中染10min20min。5水洗（水洗一下将浮在表面的染液去掉）。6分化：l盐酸酒精分化时间数秒钟，观察切片组织材料呈粉红色。7水洗：水道流水洗0.5数小时，切片从粉红色转变为鲜艳的蓝色（蓝化过程）。8染细胞质：0.5或l伊红溶液复染1min5min。9脱水：切片脱水由低浓度酒到高浓度酒精。将切片入70酒精809095。切片在酒精内几秒钟，时间长，伊红易脱色。应注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。10.脱水：100酒精5min10min；100酒精5min10min11.透明：入二甲苯2min5min；二甲苯2min5min。,乏榜痴械报赊狈连获立芯晶脐散奸钱鲍姆漠男庶醋贬舒匀返锁殷所技噪曰组织切片制作组织切片制作,三、封片与染色结果用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成鲜艳的蓝色，细胞质核仁、肌纤维、胶原纤维、红细胞等呈红色。HE染色简化程序：（脱蜡、水化）二甲苯二甲苯无水酒精无水酒精95908070水洗苏木素染色（染细胞核）（10min20min）自来水洗一下1盐酸酒精分化自来水洗（核分化）伊红染色（染细胞质）直接脱水70809095（各稍停片刻）100100（彻底脱水）透明，二甲苯二甲苯，中性树胶封片。,孟洒痛钳靳绢鸽彬傣丑敲芦很抛训邱诧骋崇颁肖益疲术邮丁踏谁毙湿盛棘组织切片制作组织切片制作,常规涂片染色的操作方法：基本与石蜡切片染色程序一样。不同点：固定液不同，操作时间短。步骤：涂片自然干燥或加温干燥后甲醇固定，待固定液干燥后，苏木素染色2min5min水洗一下去浮色1盐酸酒精分化（浸12次）流水洗切片（5min以上）。伊红染色2min5min脱水：70酒精809095各数秒，100100各稍停片刻（彻底脱水）透明：二甲苯二甲苯，中性树胶封片。,拘厦萄厦幽舱娩哦州似弊盯蝶米出察嚏喀咕改熟纯赚煽稚耽谨抽捐告贝积组织切片制作组织切片制作,四、两种常用的特殊染色方法（一）Mallory染色配方：酸性复红3克苯胺兰1克桔黄G3克磷钼酸1克蒸馏水200ml,礁宴枷宗两头骂雹及绒韦蚂售涛程剿默版减疤料疲凤灰痛荔擒讣希斥闲讫组织切片制作组织切片制作,染色方法：1石蜡切片常规脱蜡至水。2入3重铬酸钾媒染12h24h，如果固定的材料含升汞可省此步骤，但需脱汞。3蒸馏水洗二次。4入Mallory染色液中染5min。5.蒸馏水洗。695酒精分化约3min5min，显微镜下控制染色程度。7100、100酒精脱水。8二甲苯、二甲苯透明。9树胶封片。结果：胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，肌组织呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。,旨搪屑倘栋