第十一章抗生素_1002

1,第十一章抗生素类药物分析,第一节概述特点：化学纯度较低,同系物多，异构体多，降解物多，稳定性差。鉴别方法：生物学法，理化方法特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌，组分分析，聚合物等。,2,含量测定或效价测定微生物学法通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。其原理恰好与临床应用要求一致，更能确定抗生素的医疗价值。对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法是首选的效价测定方法。,3,本法的优点：灵敏、用量小，结果直观适用范围广：纯度好的、差的制品，已知或新发现的抗生素均适用，同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价。缺点：操作步骤多，测定时间长，误差大等。,4,理化方法适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素优点：迅速、准确、有较高的专属性。缺点：对含有具同样官能团杂质的供试品不适用，或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总的含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。,5,第二节-内酰胺类抗生素,头孢菌素族,青霉素族,一、化学结构与性质,*,*,*,*,*,6-氨基青霉烷酸,7-氨基头孢菌烷酸,6,酸性：青霉素和头孢菌素分子中的游离羧基具有相当强的酸性，大多数青霉素的pKa在2.52.8之间，能与无机碱或某些有机碱形成盐。旋光性：青霉素族分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。,7,-内酰胺环的不稳定性：-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子（铜、铅、汞和银）或氧化剂等作用下，易发生水解和分子重排，导致-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。,8,二、鉴别试验（一）呈色反应羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。茚三酮反应（侧链含-氨基酸结构）与重氮苯磺酸的偶合反应（侧链含酚羟基）硫酸-甲醛试验,9,（二）各种盐的反应钾、钠离子的火焰反应有机胺盐的特殊反应（如普鲁卡因青霉素的重氮化-偶合反应）（三）色谱法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法（TLC）中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。,10,（四）光谱法IR各国药典对收载的-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素共有的特征峰：内酰胺环羰基的伸缩振动（17501800）仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动（3300cm-1，1525cm-1，1680cm-1）羧酸离子的伸缩振动（1600cm-1、1410cm-1）UV利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物的最大吸收波长鉴定法。,11,三、特殊杂质的检查本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。,12,聚合物HPLC法聚合物的检查采用分子排阻色谱法。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶（sepharose）等为填充剂。现以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定为例,13,色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40120m）为填充剂，玻璃柱内径1.31.5cm，床体积5060mL；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1mL；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液进样200L进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200L，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。,排阻分子量在1000左右,14,对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶100g/1mL的溶液，摇匀。测定法：取本品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立即进样200L，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200L注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。,15,自身对照外标法的原理：该法是利用特定条件下-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物，即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标，按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。,Kav=有效分配系数,16,流动相B0.01%十二烷基硫酸钠溶液,流动相A含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,缔合物,高聚物,A高聚物A缔合物,17,有关物质和异构体例1头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查：色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯3-异构体之间的分离度R1.5。头孢呋辛酯A，B异构体、3-异构体及E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。异构体供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。有关物质按自身对照法测定，E异构体不得过1.0%；3-异构体不得过1.5%；其他单个杂质不得过0.5%并规定了总杂质量不得过3.0%。,18,1头孢呋辛；2异构体B；3异构体A；43-异构体；5,6E异构体,3-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得，E异构体经紫外光照射24h制得。,头孢呋辛酯是由两个非对映异构体头孢呋辛酯A和B组成的混合物,19,吸光度如青霉素钠（钾）的吸光度检查：取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.800.88。此法中264nm处吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的量。,20,四、含量测定高效液相色谱法这是-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种，应用HPLC法测定含量的有50多种，约占78%。本类药物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外标法计算含量。,21,第三节氨基糖苷类抗生素,这类抗生素的化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素。主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。,22,一、化学结构与性质,链霉素,链霉素,23,庆大霉素,24,二、鉴别试验茚三酮反应本类抗生素具羟基胺类和-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反应水解，产生葡萄糖胺衍生物，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。,25,麦芽酚（Maltol）反应,在碱性溶液中，链霉糖经分子重排、扩环、消除反应，生成麦芽酚，与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。,麦芽酚,紫红色,为链霉素的专属反应,26,坂口（Sakaguchi）反应链霉素水溶液加氢氧化钠试液，水解生成链霉胍与8-羟基喹啉、次溴酸钠反应，生成橙红色化合物。,为链霉素的专属反应,27,三、特殊杂质检查及组分分析1、链霉素中链霉素B的检查链霉素B是指甘露糖链霉素，由发酵产生,其生物活性仅为链霉素的20%25%，能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。中国药典（2005）新规定了该项检查，采用薄层色谱法测定。,28,溶液配制供试品溶液：取本品0.25g，精密称定，置回流瓶中，加入5ml新鲜配制的硫酸-甲醇溶液（397）溶解，加热回流1h，冷却，用甲醇冲洗冷凝管，合并冲洗液，并用甲醇定量稀释成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液。对照溶液：精密称取甘露糖对照品约36mg，置回流瓶中，同法处理后定量制成每1ml中含72g的溶液，作为对照溶液。,29,TLC方法薄层板：硅胶G点样：各10l，分别点于同一薄层板上展开剂：甲苯-醋酸-甲醇（502525）显色剂：新鲜配制的1，3-萘二酚与硫酸混合溶液，在110C加热数分钟显色。限度：供试品溶液所显链霉素B斑点的颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深（3.0%）。,根据1mg甘露糖相当于4.13mg的链霉素B，则:,限量？,30,2、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查：供试品溶液：150mg/mL；标准品溶液（1）1.5mg/mL；标准品溶液（2）3mg/mL；标准品溶液（3）1.44mg西索米星/mL，点样：各2L，展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（4：4：2）显色：0.2%茚三酮溶液，110加热20min。,31,结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色与标准品溶液（3）所显主斑点相比较，不得更深（1%），其他杂质与标准品溶液（1）所显主斑点相比较，均不得更深（1%），如有一点超过，应不深于标准品溶液（2）的主斑点（2%）。注：奈替米星是由西索米星经化学衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能残留西索米星，需进行控制。,供试品溶液：150mg/mL；标准液（1）1.5mg/mL；标准液（2）3mg/mL；标准液（3）1.44mg西索米星/mL,32,3、庆大霉素C组分测定庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效。因此各国药典均规定控制各组分的相对百分含量。庆大霉素无紫外吸收，当采用HPLC-紫外检测器检测时，需进行衍生化处理。由于其具有强极性和水溶性，为获得理想的色谱结果，可采用离子对色谱法，以庚烷磺酸钠为反离子。,33,如USP（29）利用庆大霉素C组分结构中的氨基与邻苯二醛（OPA）、巯基醋酸在pH10.4的硼酸盐缓冲液中反应，生成1-烷基-2-烷基硫代异吲哚衍生物，在330nm波长处有强吸收。,ChP和BP曾采用USP同样的方法测定庆大霉素C组分，但在现版药典中分别改用了蒸发光散射检测器和电化学检测器。,庆大霉素,OPA,巯基醋酸,异吲哚衍生物,34,ChP（2005）采用蒸发光散射检测器检测色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（pH值范围0.88.0）；0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）为流动相，流速0.6ml/min；蒸发光散射检测器检测,35,系统适用性试验分别称取庆大霉素和小诺霉素标准品各适量，用流动相制成每1ml中各含0.2mg的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图.C组分的出峰顺序从第二个主峰计，依次为庆大霉素C1a、C2、小诺霉素、C2a、C1；C2、小诺霉素和C2a峰之间的分离度应符合要求；连续进样的小诺霉素峰面积的相对标准偏差应不大于2.0%。,36,测定法取小诺霉素标准品适量，精密称定，分别用流动相制成每1ml中约含小诺霉素0.2mg、0.5mg和1.0mg的溶液作为标准品溶液（1）、（2）、（3）。取上述三种溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算标准品溶液浓度的对数值与相应的主峰面积对数值的回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；,r0.99,37,另取本品适量，精密称定，用流动相制成每1ml中约含庆大霉素2.5mg的溶液，同法测定，用回归方程计算供试品中对应各组分的量（Xcx），并根据所得的各组分的量（Xcx）按下面公式计算出各组分的含量。,式中Cx为庆大霉素各组分的含量；C1应为25%50%，C1a应为15%40%，C2a+C2应为20%50%。,38,第四节四环素类抗生素,这类抗生素分子有四个环构成，故统称为四环素类（tetracyclines）抗生素。一、化学结构与性质,化学结构：四环素类抗生素，可以看作四骈苯或萘骈萘的衍生物。,39,性质1、酸碱性（具两性）2、旋光性（有多个手性碳）3、紫外吸收和荧光（刚性平面结构）4、与金属离子形成配位化合物5、不稳定性四环素类抗生素对各种氧化剂（包括空气中氧在内）、酸、碱都是不稳定的，易发生差向异构化、降解等反应。,40,二、鉴别试验1、浓硫酸反应四环素类抗生素遇硫酸立即产生各种颜色2、三氯化铁反应分子结构中具酚羟基，遇三氯化铁试液即呈色3、薄层色谱法采用硅藻土作载体，为了获得较好的分离，在粘合剂中加有聚乙二醇400、甘油以及中性的EDTA缓冲液。EDTA可以克服因痕量金属离子存在而引起的斑点拖尾现象。,41,三、特殊杂质检查1、有关物质四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和贮藏过程中易形成的异构杂质、降解杂质：差向四环素（ETC）、脱水四环素（ATC）、差向脱水四环素（EATC）等。中国药典和USP（25）、BP（2000）均采用高效液相色谱法控制四环类抗生素的有关物质。,42,2、杂质吸收度四环类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的外观色泽变深。因此中国药典和BP均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸收度的限量。,43,四、含量测定,四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用高效液相色谱法。色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱（pH值适应范围大于8.0）；0.1mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液（68275），用氨试液调节pH值至8.3为流动相；流速1ml/min；柱温35；检测波长为280nm。,44,系统适用性试验称取盐酸四环素约15m