（药物化学专业论文）设计并合成αgal复合类疫苗前体.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。一 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库：( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 扬品 2 0 1 0 年5 月2 4 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目设计并合成x g a l 复合类疫苗前体 姓名杨品 学号 2 1 2 0 0 7 0 7 3 5 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 1 日 论文类别博士 口 学历硕士团硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所药学院专业药物化学 联系电话 l5 8 2 2 8 8 6 9 41 e m a i l y a n g p i n _ 0 0 6 1 6 3 c o r n 通信地址( 邮编) ：天津市南开区南开大学卫津路9 4 号南开大学天南大联合楼d 6 0 1 备注：无是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开人学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库：( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 13 2 0 161 ：8 0 01 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩： 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：霸三 2 07c 7 年参月a 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目设计并合成e t g a l 复合类疫苗前体 姓名 杨品学号 2 1 2 0 0 7 0 7 3 5 答辩日期0 0lo 年箩月纠日 论文类别 博士口 学历硕士回硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所药学院专业药物化学 联系电话 l5 8 2 2 8 8 6 9 4le m a i l y a n g p i n _ 0 0 6 16 3 c o r n 通信地址( i l b 绷) ：大淬币雨升隧罔升犬学卫绰跆9 4 号雨升大字大雨大联合梭d 6 0 1 备注： 杀， 是否批准为非公开论文 圣 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 1 i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：扬昌2 0 1 0 年5 月 2 4 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 a g a l 表位是指端基含有g a la ( 1 _ 3 ) g a l 结构的糖类化合物，它广泛存在于除 了人、旧大陆猴和猿以外的大多数哺乳动物的细胞表面。而人体循环系统中存 在大量天然的抗体( a n t i g a l ) 。一旦有外来的a g a l 表位侵入，a n t i g a i n 与之发生 强烈的急性排斥反应，这是异种器官移植失败的重要原因。后来人们就开始研 究如何消除这种免疫反应使异种器官移植成功。在研究过程中人们发现，在肿 瘤细胞表面修饰上a g a l ，可以引发体内的免疫系统对肿瘤细胞进行杀伤，从而进 行肿瘤的免疫治疗。 鉴于a g a l 表位上述的生物意义，我们设想如果通过合适的连接臂将其通过共 价键连接到具有药用价值的分子或者蛋白上，就可能形成新一代的更有效的a g a l 复合类药物或者疫苗。我们设想这种新型的化合物绑定在病毒上，那么在病毒 的表面将覆盖一层a g a l 表位，这会诱导a n t i g a l 介导的免疫体系最终杀死病毒。 因此我们设计t g a l a ( 1 _ 3 ) g a l d ( 1 - 4 ) g l c d 1 r i g _ 样一个双官能团化合物作为 抗肿瘤疫苗或者药物前体。在本论文中，我们利用硫苷法成功的用糖供体 2 ( 2 ，3 ，4 ，6 四o 苄基d d 吡喃半乳糖苯基硫苷) 和糖受体3 ( 2 ，4 ，6 三o 乙酰基1 3d 吡喃半乳糖基( 1 _ 4 ) 2 ，3 ，6 三o 乙酰基p d 吡喃葡萄糖苷叠氮) 合成了a 构型的 三糖，并利用c l i c k 反应对其进行修饰，最终利用十四步反应合成了目标化合物， 其中包括十二个中间体。在合成糖供体和受体的过程中，我们利用重结晶的方 法代替了柱层析，使分离过程简化，目标化合物及中间产物的结构均经过1 h n m r 、1 3 cn m r 、质谱或着高分辨质谱的确认。 关键词：a g a l 表位a n t i g a l 抗体疫苗 a b s t r a c t ab s t r a c t t h ea g a le p i t o p e s ( o l i g o s a c c h a r i d e s 、) l ，i t i lt e r m i n a lg a l a1 - - - 3 g a ls t r u c t u r e ) a r e a b u n d a n t l ye x p r e s s e do nc e l l so fm o s tm a m m a l s ，e x c e p th u m a n s ，a p e s ，a n do t h e ro l d w o r l d m o n k e y s i ti sk n o w n t h a tn a t u r a la n t i g a la n t i b o d i e sa r ea b u n d a n ti nh u m a n s a st h ea g a l e p i t o p e i s r e c o g n i z e d 嬲f o r e i g n , t h ea n t i - g a l a n t i b o d i e sa r e i m m e d i a t e l yr e a c t e dw i t hi t t h i sr e a c t i o ni sm a i n l yr e s p o n s i b l ef o rt h eh y p e r a c u t e r e j e c t i o ni nx e n o t r a n s p l a n t a t i o n t h e np e o p l eb e g a nt os t u d yh o wt oe l i m i n a t et h e i m m u n er e s p o n s et ot h es u c c e s so fx e n o t r a n s p l a n t a t i o n i nt h ec o u r s eo ft h es t u d yi t w a sf o u n dt h a tt a g g i n gt u m o rc e l ls u r f a c e sw i t ha g a le p i t o p e sw i l li n d u c et h eb o d y s i m m u n es y s t e md e s t r u c t i o no ft u m o rc e l l st oi m m u n et h e r a p yf o rc a n c e r t a k ea d v a n t a g eo fa g a le p i t o p e s 7 b i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e ，w eh y p o t h e s i z et h a tb y c o v a l e n t l ya t t a c h i n gt h ea g a le p i t o p et ot h ep h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n so rm o l e c u l e s t h r o u g ha p p r o p r i a t el i n k e r s ，an e wg e n e r a t i o no fa g a l c o n j u g a t e da g e n t so rv a c c i n e s m a yb ed e v e l o p e df o rm o r ee f f e c t i v et r e a t m e n to fd i s e a s e w ee n v i s a g et h a tt h e c o n j u g a t e ，o n c eb o u n d t ot h ev i r u s ，w i l lc o a tt h ev i r u s 谢t ha g a le p i t o p e s ，w h i c hw i l l t h e ni n d u c ea na n t i - g a l - m e d i a t e di m m u n er e s p o n s ea n dr e s u l ti nt h ek i l l i n go ft h e v i r u s t h e r e f o r e ，w ed e s i g n e dab i f u n c t i o n a lc o m p o u n d s ，g a l - 仅( 1 一3 ) 一g a l p ( 1 4 ) g l c - 1 31 一心a st h ea n t i c a n c e rv a c c i n eo rd r u gp r e c u r s o r s i nt h i sp a p e r ，w es y n t h e s i s t h e a g a l c o n j u g a t e dc o m p o u n db yu s i l 培t h e d o n o r 2 ( p h e n y l 2 , 3 ，4 ，6 - t e t r a - o - b e n z y l 一1 t h i o p - d g a l a c t o p y r a n o s i d e ) a n d a c c e p t o r 3 ( o 一( 2 ，4 ，6 t r i - o a c e t y l p d g a l a c t o p y r a n o s y l ) 一( 1 寸4 ) - 2 ，3 ，6 t r ioa e e t y l 一1 9 - 0 一g t u c o p y r a n o s y la z i d e ) ，a n dm o d i f yi tu s eo fc l i c kr e a c t i o n t h et a r g e tc o m p o u n dw e r e s y n t h e s i z e dt h r o u g h14s t e p s ，i n c l u d i n g12i n t e r m e d i a t e s i nt h ep r o c e s so fs y n t h e s i s o fs u g a rd o n o ra n dr e c e p t o r , w eu s e dr e c r y s t a l l i z a t i o nm e t h o dt or e p l a c et h es i l i c a g e lc o l u m n , w h i c hs i m p l i f yt h es e p a r a t i o np r o c e s s t h et a r g e tc o m p o u n d sa n d i n t e r m e d i a t e sw e r ed e t e r m i n e db y1 hn m ra n d1 3 cn m r a n ds o m eo ft h e m c o n f i r m e db ym sa n dh r m s k e y w o r d s ：a g a le p i t o p e s a n t i g a la n t i b o d y v a c c i n e s l i 1 1 ：； 4 第三节t h ea g a lh y p e r a c u t e 技术提高免疫能力的机理6 1 3 1a g a lh y p e r a c u t e 技术机理6 1 3 2t h ea g a lh y p e r a c u t e 技术的特点。8 1 3 3 修饰a g a l 的方法8 第四节a g a l 表位与疫苗9 1 4 1 对疫苗结构的普遍性需求1 0 1 4 2c t g a l 在肿瘤方面的应用。1 0 1 4 3a g a l 在抗病毒疫苗方面的应用11 第二章课题设计12 第一节课题背景1 2 2 1 1 课题研究的意义背景1 2 2 1 2 目标分子的设计12 第二节目标化合物的合成策略及路线分析1 5 2 2 1 目标化合物的逆合成分析。l5 2 2 2 目标化合物的合成路线1 6 i i i 目录 第三章实验部分1 9 第一节半乳糖供体的合成19 3 1 1p d 吡喃半乳糖苯基硫苷( 5 ) 2 0 3 1 22 ，3 ，4 ，6 四一。苄基1 3 - d 吡喃半乳糖苯基硫苷( 2 ) 2 0 第二节乳糖受体的合成2 0 3 2 1 全乙酰化的乳糖( 7 ) 2 0 3 2 22 ，3 ，4 ，6 四一o - 乙酰基一p - o - l t 喃半乳糖基- ( 1 - - 4 ) - 2 ，3 ，6 一- - - - o - 乙酰基- 1 3 d - r i f t 喃 葡萄糖溴苷( 8 ) 2 1 3 2 3 2 ，3 ，4 ，6 - 四- o - 乙酰基p d 吡喃半乳糖基- ( 1 - - 4 ) - 2 ，3 ，6 一三一o 乙酰基1 3d 吡喃 葡萄糖苷叠氮( 9 ) 2 2 3 2 41 3 - d 吡喃半乳糖基- ( 1 - - 4 ) 1 3d 吡喃葡萄糖苷叠氮0 0 ) 2 2 3 2 5 【3 - o - ( 4 - 对甲氧基苄基) 一p d 吡喃半乳糖基】- ( 1 - 4 ) - 1 3 - d 一吡喃葡萄糖苷叠氮( 1 1 ) ：! ：； 3 2 6 3 一o ( 4 对甲氧基苄基) 一2 ，4 ，6 - 三一o - 乙酰基一p - d 一吡喃半乳糖基】( 1 4 ) - 2 ，3 ，6 - 三_ o 乙酰基f l - d 吡喃葡萄糖苷叠氮( 1 2 ) 2 4 3 2 72 , 4 ，6 一三旬一乙酰基1 3 - d 吡喃半乳糖基羽一4 ) 一2 ，3 ，6 - 三一0 - 7 , 酰基一p - d 一吡喃葡 萄糖苷叠氮( 3 ) 2 4 第三节目标化合物t x g a l 表位的合成2 5 3 3 1 o - ( 2 ，3 ，4 ，6 - 四_ o 苄基- a d 吡喃半乳糖基) 一( 1 - 3 ) - o - ( 2 ，4 ，6 - 三一o 一乙酰基- p d - 吡喃半乳糖基) - ( 1 - - 4 ) - 2 ，3 ，6 - - - - 0 一乙酰基一l - p d - 吡喃葡萄糖苷叠氮( 1 ) 一2 5 3 3 2 化合物1 2 的合成2 6 3 3 3 化合物1 3 的合成2 7 3 3 4 化合物1 4 的合成2 7 第四章结果与讨论2 9 第一节糖苷键的合成方法2 9 4 1 1 糖苷键的立体选择性2 9 4 1 2 糖供体的合成3 0 4 1 3 乳糖供体的合成3 l 4 1 4 昏糖苷三糖的合成3 l i v 目录 第二节锡在糖类化合物合成中的应用3 3 第三节苄基脱保护实验过程中出现的问题及解决方案3 4 第四节化合物1 4 的鉴别和下一步反应。3 6 4 3 1 化合物1 4 的鉴别3 6 4 3 2 下步反应的准备3 9 第五章全文总结4 0 参考文献。41 致谢4 7 附录：实验谱图4 8 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果6 4 v 第一章绪论 第一章绪论 感染性疾病是当前世界范围内严重危害人类健康的难题之一，疫苗作为一 种特殊药物能有效地刺激机体产生特异性的抗体或激活免疫细胞抵御外来病 毒、寄生虫或细菌的侵入。因此，发展新型的预防、治疗性的疫苗是十分重要 的。 由于糖基化是生命过程中普遍存在的现象，而承载重要生物学功能的糖缀 合物的糖链在病理过程中的异常和高表达以及异种生物糖链的特异性，使糖类 化合物作为抗原决定簇而引起特异免疫反应，已为实验所证实。1 9 9 7 年， d a n i s h e f s k y 及其同事完成了腺癌k h 1 及g l o b oh 抗原的制备【1 1 ，从而开始了糖 类疫苗的快速发展。现在针对新生儿、幼儿肺炎和脑膜炎的h i b 疫苗已经上市 了，而针对疟疾、肿瘤、艾滋病等疾病的糖类疫苗也处于不同的研究阶段【2 】。 第一节糖在生物体内的重要作用 糖类化合物与核酸、蛋白质一起并成为三大生命物质，但是由于其结构的 多样性和复杂性，使得人们对它的生物学作用了解进程比较缓慢。近年来，随 着现代分离、分析技术的进步及生物学研究的不断深入，人们对糖类化合物重 要的生物学活性有了越来越多的认识。2 0 0 1 年3 月2 3 日出版的美国科学杂 志( v 0 1 2 9 1 ，n o 5 5 1 2 ) 汇编了由7 篇综述和6 篇简介组成的一个“糖和糖生物学 专辑。在此专辑前有一篇导论，题为“灰姑娘的马车己经来了 【3 】，预示着糖化 学将得到越来越多的关注及重视。许多与糖有关的学科如糖化学、糖生物学、 糖免疫学等逐渐形成并得到了发展【4 】。 1 1 1 糖的生物学意义 关于糖类的研究是从大约1 0 0 多年前德国著名科学家e f i s h e r 开始的。而 到1 9 2 3 年m h e i d e l b e r g e r 和t o s w l d 则提出细菌的抗原是由糖类物质组成而 不是蛋白质，从而人们开始关注糖的生物作用。随着研究的不断深入，人们发 现糖类物质具有多方面的、复杂的生物活性，如细胞间的通讯、识别相互作用， l 第一章绪论 胚胎的发生、转移，信号的传递，细胞的运动与黏附，抗微生物的黏附与感染 及调节机体的免疫功能等等。 由于细胞表面密布着糖被，具有不同结构和组成的糖蛋白、糖脂和蛋白聚 糖等糖复合物宛如天线一样( 图1 1 ) ，加之糖的结构多样性，因此糖类携带的信 息量远远超过了蛋白质和核酸。越来越多的事实证明，糖复合物中的寡糖是体 内重要的信息分子，对人类的疾病的发生、发展和预后起着重要的作用，同时 也是一类重要的治疗药物。糖类物质作为药物的主要功能有以下几个方面【5 - 6 ： 对免疫系统的影响；多糖、寡糖药物降血糖的作用；抗辐射、抗病毒作用、抗 类风湿关节炎的糖类药物；以糖类物质为基础的疫苗。 研究表明糖及其缀合物( 糖蛋白、蛋白多糖、脂多糖等) 与生物信息有着密不 可分的联系，它们作为信息物质参与及调控生物细胞的生长发育、分化、代谢、 识别反应、生物的生命过程，作用于神经系统、免疫系统的正常维持【7 】，与许多 疾病的发生与发展有这密切的联系【8 】。哺乳动物细胞表面存在着种类繁多的糖蛋 白和糖脂，这些糖蛋白和糖脂上的寡糖链编码生物信息，参与对其他细胞、病 图1 1 生物体系中的糖结构 毒、细菌或者毒素表面糖蛋白( 凝集素) 的识别和结合过程( 图1 2 ) 【9 1 ，而且研究发 现肿瘤细胞内糖基化过程发生变异，导致细胞分泌性或细胞膜上的糖蛋白或糖脂 中的糖链序列发生改变。这些糖链与细胞的粘附、运动、分子识别及细胞识别 有关，糖链结构改变可能导致肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的识别而生长和转移。 例如人类血清中存在r c ai ( 蓖麻凝集素i ) 能够特异性识别具有末端g a l p ( 1 2 第一章绪论 4 ) g i c n a c 糖链序列的多糖分子，利用r c ai 的这一特性，可用于肿瘤患者血清 糖基化异常和肿瘤发病机制的研究，并可为临床诊断和治疗效果的评价提供参 考指标【i o 】。1 9 0 0 年l a n d s t e i n e r 发现了人类的主要血型a b o 1 1 】，经过半个多世 纪直到1 9 6 0 年l a n d s t e i n e r 及w a t k i n s 等确定了血型是由血细胞表面的糖蛋白和 糖脂决定的，而不同血型的根本区别仅在于这些糖缀合物中寡糖非还原端糖的 种类和结构。 m u c i n - t y p e g l y c o p r o t e i n p r o t e i n 图1 2 细胞表面蛋白与糖的相互作用示意图 1 1 2 糖生物学与免疫学 糖类物质的作为一种药物对免疫系统有着重要影响，它能维持机体免疫系 统的动态平衡，当机体免疫系统受损或功能低下时多糖和寡糖能刺激各种免疫 细胞成熟、分化和繁殖，使机体免疫系统恢复平衡，免疫系统又能行使正常的 监视、消灭外源性异物的功能，这些异物包括病原微生物、癌细胞、自身衰老 死亡的细胞等。 其实自1 9 0 0 年a b o ( h ) 抗原被发现以来，糖生物学和免疫学领域就有长期 的重叠。在过去的两个世纪中，这些抗原结构的分子基础( 在输血的过程中需要 认真考虑血型相容性) ，已经被发现是一种寡糖结构，在其结构上存在一个小的 结构性差异，有无n 乙酰半乳糖的存在；7 这种差别以a 和b 表位区分j 免疫。 3 第一章绪论 系统能够识别大的分子结构上的细小差别的能力在生物和医学方面有着重要的 意义，这种意义这远远超过了在输血过程中血型问题的解决。例如，三糖0 【半乳 糖昔酶抗原的导致异种器官移植超急性排斥反应的产生，现在正致力与创造一 个半乳糖苷酶基因敲除猪l l2 。同样，最近发现的n e u 5 g c 唾液酸类抗体会“污染” 人的骨髓干细胞系，这提高人们对引入受赠人体内你的组织工程器官的关注【1 3 】。 相比于这些例子，免疫系统与糖生物学的交叉不会被视为一个问题，而是一个 诱人的机会。总之，碳水化合物抗原的百年历史先例，在逻辑是可以利用复杂 的糖类作为疫苗和免疫治疗，而且亦有实例证实。例如将寡糖连接到载体蛋白 上所得的疫苗，如在2 0 世纪9 0 年代，研究证明一种由h i b 衍生的寡糖和蛋白 质载体耦合缀合物形式的疫苗，这种疫苗在发达国家已成为计划免疫的疫苗， 还有癌疫苗也是以糖为基础的疫苗，这些疫苗是用癌细胞表面存在的寡糖免疫 制成的。 在糖与蛋白结合的一个重要特征是二者的识别过程通常是从寡糖的非还原 端开始的，而且只有部分糖基，通常是末端的一个糖残基，深入到蛋白受体的 结合腔内，与之紧密结合，这个特异性的糖基被成为是“免疫决定糖”。g a la ( 1 - - , - 3 ) g a l 就是一种重要的“免疫决定糖”，0 c g a l 抗原在异种移植排斥中具有重要 的作用【1 4 1 。 第二节a g a l 表位与a n t i g a l 抗体 a g a l 表位是指端基含有g a la ( 1 - - - + 3 ) g a lp 的糖结构，它广泛存在于非灵长类 哺乳动物和新大陆猴( n e ww o r l dm o n k e y s ) 细胞表面的糖蛋白和糖脂的末端结 构，而人类和他们的近亲旧大陆猴( o l dw o r l dm o n k e y s ) ，猿( a p e s ) 由于缺少编码 0 1 ，3 半乳糖基转移酶的活性基因，没有该表位的生成【l ”。而在它们体内却存在 一种能够与a g a l 表位特异性结合的天然抗体一抗a g a l 表位抗体( a n t i g a l ) ，约占 血清免疫球蛋白g ( i g g ) 的1 【1 6 】。a g a l 表位的发现始于1 9 7 3 年b a s u 发现了哺乳动 物体内的0 【1 ，3 半乳糖转移酶能够与唾液酸酶在高尔基体催化合成仅g a l 表位 ( g a la ( 1 - - 3 ) g a l1 3 ( 1 - - - * 4 ) g i c n a ep r ) f 1 7 】，而1 9 8 7 年，g a l i l i 等发现了，在人、猿及 旧大陆猴体内没有a g a l 表位，但是却存在与该表位的天然抗体a n t i g a l t l 8 j ，随后 g a l i l i 等又发表了与a g a l 表位及a 1 1 t i _ g a l 相关的- - 系列文章1 5 ，1 9 。2 2 1 ，目前发现的主 要的a g a l 表位见下图( 图1 3 ) 。 4 在数分 为移植 的补体 间的屏 障，并激化多形核细胞聚集和血小板聚集，从而血管间血栓形成，最终导致移 植器官的缺血性坏死的( 图1 4 ) 。而人、猿及旧大陆猴体内天然的a n t i g a l 是因为肠 道内a g a l 表位的菌群对集体免疫系统的不断刺激而产生的【2 4 1 。 图1 4 异种器官移植中发生h a r 的示意图 鉴于人体天然存在i 拘a n t i - g a l 能有效结合到带有a g a l 表位的细胞膜上，因此 含c t g a l 表位的化合物在疾病治疗方面有重要意义。将a 1 ，3 g t ( t x l ，3 糖基转移酶) 修饰过的表达c t g a l 表位的肿瘤细胞制备成为自体肿瘤疫苗已经被用于临床免疫 5 第一章绪论 治疗的开发上【2 5 1 。 第三节t h ea g a ih y p e r a c u t e 技术提高免疫能力的机理 与一般抗病毒疫苗相比，疫苗中加佐剂的目的是刺激免疫体系对抗原做出 更加强烈的反应，另一种提高抗病毒疫苗的效力的方法是利用a g a lh y p e r a c u t e 技术激活人体内一种特殊免疫反应【2 6 j 。这项技术是基于对在细胞表面含有 g a l a ( 1 _ 3 ) g a l p ( 1 _ 4 ) g l c n a c r ( a g a l 表位) 的器官和组织的天然获得性免疫。 连有a g a le p i t o p e 的糖蛋白或糖脂在除了人、猿、古世纪猴以外的哺乳动物体内 存在。人、猿、古世纪猴由于进化的原因体内缺乏有活性的q 1 ，3 g t l 2 7 - 2 8 j ，所以 在这类生物体内没有a g a l 表位。但是由于其肠道内a g a l 表位的菌群对集体免疫系 统的不断刺激使人的循环系统中存在大量天然的抗体( a n t i g a l ) ，从而构成了一种 强有力的防止含有a g a l 表位的细胞侵入的天然屏障。一旦有外来的a g a l 表位侵 入，这种天然屏障就会发挥作用导致产生强烈的急性排斥反应。 1 3 1a g a lh y p e r a c u t e 技术的机理 a g a lh y p e r a c u t e 技术利用化学、生物或者酶法将a g a l 表位连接到抗肿瘤或 病毒疫苗上，利用上述原理提高疫苗的免疫活性。现在已有很多文献证实将疫 苗修饰上a g a l 表位是一种安全、有效地提高免疫效力的方法【2 1 ，2 9 。3 3 1 ，但是a g a l h y p e r a c u t e 技术的应用是近期才开始讨论、研究的。人类癌症基因治疗试验表明 对小鼠进行腹腔注射逆转录病毒载体细胞后随着抗肿瘤反应的同时，a n t i g a l 抗 体滴度升耐3 4 。3 5 】。对其机理的研究表明表面覆盖a g a l 表位的细胞会很快被高滴度 的a n t i a g a l 循环抗体绑定，从而导致高效率的补体结合和快速细胞裂解。这种补 体介导的细胞凋亡机理在对照实验中的到证实 3 6 j 。当a g a l 表位与特异性的 a n t i g a l 抗体形成免疫复合物也会增强人吞噬细胞对其的识别和吞噬1 3 7 】，从而激 活人体的体液免疫应答和细胞免疫应答。大概过程就是通过i g g ( 免疫球蛋白g ， g i m m u n o g l o b u l i ng ) 分子自身的f c 片段与a p c ( 抗原提呈细胞) 细胞上的 f 叭f c - g a m m ar e c e p t o r ) 受体结合，将表达a g a l 表位的细胞或细胞膜提呈给a p c 细胞，这些a p c 细胞把a g a l 表位修饰的细胞膜转运至邻近的淋巴结，激活淋巴结 内的肿瘤杀伤性t 细胞，激活的肿瘤杀伤性t 细胞将离开淋巴结，进入循环系统， 6 第一章绪论 对体内表达相应抗原的细胞进行杀伤( 图1 5 ) 。这就克服了自体肿瘤疫苗，由于其 a ( t u m o ra s s o c i a t e da n t i g e n 肿瘤相关抗原) 的免疫原性较弱，而不能有效的将 肿瘤相关抗原提供给免疫系统的障碍。 现在认为基于a g a l 超级免疫排斥反应疫苗接种的生物机理是a g a l 表位与 a n t i g a l 的结合，发挥抗体f c 段的调理作用，与a p c 细胞表面i 拘f c y 受体结合，能 够起到促进a p c 细胞的抗原识别和呈递作用，从而促进a p c 对肿瘤细胞的吞噬。 事实上，a n t i g a l 是人体内唯一的把目标抗原转移到a p c 细胞的抗体，而且 是在体内大量产生的无处不在的自然抗体 3 8 - 3 9 l 。因此，任何含有a g a l 表位的微粒 或可溶性抗原将与a n t i g a l 形成免疫复合物，有效地被a p c 为目标吸收【4 0 - 4 2 1 。由 注射a g a l 疫苗后a n t i g a l 抗体调理作用引发的。这就引发了细胞凋亡和抗原提呈 的几个原理：首先，a g a l 表位的抗体调理促进补体介导的细胞裂解和f c 受体介导 的吞噬作用( 一种抗原摄取和加工非常有效的机制) 。例如，a g a l 修饰后的破伤风 类毒素的吸收增加至1 0 0 0 f o l d 4 3 1 。其次，补体介导的细胞溶解会产生“危险信 号 m 4 5 。，这种信号对于注射部位产生的免疫反应由很多影响。这些危险信号 是抗原呈递细胞的活化、分裂成成熟树突细胞的关键。超急性细胞疫苗产生的 碎片，作为一种通过刺激热休克蛋白的释放达到辅助免疫的作用却】。另外， 补体活化会导致过敏毒素释放，诱导发炎和抗原提呈细胞的补充。 总之，a g a l 超急性疫苗的一个主要的特点是疫苗接种后几分钟之内就可以达 到有效的的病毒疫苗的破坏，引起a p c s 的补充，增1 j 1 f e y 介导的吞噬作用和抗原 吸收，从而激活免疫反应的细胞和体液，这种强烈的初次免疫反应( 包括更有效 地诱导抗病毒免疫和大量的记忆细胞) ，达到长期持久的抗病毒效果。 7 第一章绪论 图1 5a n t i g a l 介导的肿瘤相关性抗原免疫原性的放大模式图 1 3 2t h ea g a lh y p e r a c u t e 技术的特点 c t g a l 表位经常被认为是一种佐剂，是因为它能促进抗原快速提交给a p c s ， 引起强烈的免疫反应。但不同于传统的佐剂被当成疫苗形成的补充成分加入， a g a l 表位是直接连接在疫苗抗原上。另外，传统的佐剂激活先天免疫系统，而a g a l 刺激的是人体内自然获得- l 生a g a l 免疫途径，这种免疫途径作为一种强有力的天然 屏障防止细菌感染。a g a l 优于传统佐剂的原因是它兼具抗原和类佐剂的双重特 性。a g a l 表位( 抗原) 可以被a n t i g a l 抗体所识别( 佐剂) ，通过f c y r 将c t g a l 修饰的疫 苗提供给抗原提呈细胞。重要的是，对a g a l 自然进化的免疫性可以确保在抗原上 有a g a l 表位就会引起强烈的免疫反应，包括以分泌细胞因子和增加吞噬细胞活性 为特征的t i l l 免疫的交错激活、以抗体滴度高为特征的t h 2 免疫。 1 3 3 修饰o t g a l 的方法 候选抗病毒疫苗修饰a g a l 方法一般分三种即生物、酶法和化学的方法。 生物方法增) j l ：l a g a l 表位：生物法修饰是用0 【1 ，3 g r 细胞株增) b l ：l c t g a l 表位。这 些细胞株可以是从生物体中提取的自然的0 【1 ，3 g r ，也可以是由u 1 ，3 g t 细胞株 ( 例如h e k 2 9 3 ) 暂时或者稳定表达的a l ，3 g t 。生物法是在体内蛋白上合适的位点 用0 【1 ，3 g t 进行有n 连接的糖基化。不过，由于有其他糖基转移酶和a 1 ，3 g t 竞争 8 第一章绪论 底物n 乙酰乳糖胺残基，而且由于需要糖基转移酶的表达水平因不同细胞类型 而异，所以连接上的a g a l 的数目不可能与n 连接糖基化的位点数线性相关。虽 然n - 连接的a g a l 表位数量和依赖a g a l 增强的免疫性之间的的关系还没有建立起 来，但是通过生物手段增力h a g a l 表位后引起免疫原免疫原性显著增强【4 8 5 1 1 。 酶法增力l ：l a g a l 表位：酶法与生物方法不同，它是利用细菌或酵母源性的纯化 的a l ，3 g t 和端基含有n 乙酰乳糖胺基的病毒颗粒( 或者肿瘤细胞或薄膜上的n 乙酰乳糖胺基可以用神经氨酸酶除去终端的唾液酸) 在体外合h - 茈a g a l 表位【2 9 5 2 1 ， 以前有文献报道用酶法修饰抗病毒疫苗后，其免疫原性增加【3 3 】。 化学方法增n a g a l 表位：化学法修饰可以使连接到蛋白质肽为基础的抗病 毒疫苗上的a g a l 表位的数目达到最高。化学方法一般是用a g a l = 糖耦合上一个 碳链( 长度可选) ，在碳链的另一端连有马来酰亚胺或琥珀酰亚胺基团，这些基团 可以分别和半胱氨酸或赖氨酸残耦合【5 3 】。与在n 连接的糖基化位点( 生物和酶 法修饰a g a l 的模板) 相比，在糖蛋白表面通常有更多的活性位点( 终端胺等) ， 因此与另外两种方法相比，在任何特定的蛋白质用化学法修饰，a g a l 的数量都会 大幅度增加。此外，偶联反应是非常有效的反应。化学法增j j l ：l a g a l 表位是一个很 好的选择，特别是在当反应底物不含有n 乙酰乳糖胺残基时。 第四节a g a l 表位与疫苗 上世纪八十年代，因为糖生物学发展的滞后直接导致了糖类化合物的生物 学作用鲜为人知，也使糖类化合物的研究长期被药学家所忽视，但是近几十年 来随着糖生物学的快速发展，糖类化合物的众多生物学功能逐渐为人们所熟知， 随之糖类化合物的药物作用也越来越受重视。目前糖类药物的使用和销售量已 在药物市场上占有很大的比例。据统计现在市场上销售的糖类药物的数量大约 有5 0 0 余种。 由于寡糖或糖复合物主要分布在细胞表面，参与了细胞和细胞、细胞和活 性分子间的相互作用，这种相互作用与人体的生理和病理过程有关【5 4 1 。由于多 数以糖类为基础的药物的作用位点是在细胞的表面而不是进入细胞内部，因此 这类药物对于整个细胞或者整个有机体的干扰，要比进入细胞质、细胞核的药 物小很多。因此糖类药物是毒副作用相对小的一类药物。另外糖类在人体内可 以水解，变为营养和能量，这对治疗癌症有格外重要的意义。迄今为止，有关 9 第一章绪论 糖类药物的综述性文章和专著也日益增岁5 5 1 ，糖类药物涉及的临床适应症主要 包括肿瘤、糖尿病、a i d s 、流行性感、细菌感染和风湿性关节炎等。 1 4 1 对疫苗结构的普遍性需求 在2 0 0 多年以来，j e n n e r 已证明了疫苗的成功性，现在任何疫苗设计和开发 的一般步骤：首先，必须完成对抗原结构特性的确定。在非肽类抗原的情况下， 抗原表位的结构知识对抗原或者类似物的化学合成很有帮助。一旦获得了适当 的复合物，在动物模型免疫学研究中必须对疫苗的有效性进行评估，由疫苗引 起的抗体与靶抗原的相互作用应该进行详细的独立研究，这对于那些被动免疫 策略尤其重要，例如利用t a c a ( t u m o r - a s s o c i a t e d