（药学专业论文）peg接枝巯基化壳聚糖微凝胶的黏附性及其促渗性研究.pdf

摘要 壳聚糖引入聚乙二醇可增强其生物相容性，巯基化改性可提高其生物粘附性 和对药物的促渗性。本文通过合成出巯基化聚乙二醇壳聚糖，并制备成微凝胶， 对其生物粘附性和药物的促渗性进行了研究。 主要结论如下： 以壳聚糖( c s ) 和单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) 为原料合成出不同接枝率的单 甲氧基聚乙二醇壳聚糖。利用两相分光光度法测定了接枝率。对反应的各种溶剂 进行了筛选，并考察了反应投料的配比、时间、温度对反应接枝率的影响。控制 活化单甲氧基聚乙二醇和壳聚糖的投料比例为2 ：l ，反应时间1 8 h ，温度为3 7 可以得到接枝率为8 4 的单甲氧基聚乙二醇壳聚糖。 以合成的单甲氧基聚乙二醇壳聚糖为原料，通过毓基化反应，制备出了不同 巯基化程度的聚乙二醇壳聚糖。用e l l m a n s 试剂法测定了产物中巯基的含量，并 考察了反应投料比和催化剂对锍基含量的影响。控制毓基乙酸和聚乙二醇壳聚糖 的比例为2 ：1 ，在催化剂n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和e d c h c l 的作用下，可 制得巯基含量为3 7 3 1 肛m o l g 毓基化聚乙二醇壳聚糖。 以巯基化聚乙二醇壳聚糖为原料，通过阴离子交联剂三聚磷酸钠( t p p ) 进 行交联，制得微凝胶。经粒度分析，微凝胶的平均粒径在1 5 0 2 n m 左右。以牛血 清蛋白( b s a ) 为药物模型，研究了微凝胶的包封率，载药率和体外释放性能。 微凝胶对牛血清蛋白的包封率和载药率分别可达5 5 和6 5 ，在各种酸性缓冲 液中释放稳定。 以猪胃粘蛋白( h g m ) 为药物模型，测定了微凝胶的体外生物粘附性。巯 基化聚乙二醇壳聚糖微凝胶在p h 3 0 ，6 8 ，7 4 下均有良好的粘附率。 以紫杉醇为药物模型，测定了微凝胶的体外药物促渗性。当聚乙二醇接枝率 为8 9 7 ，巯基含量为3 7 3 i “m o l g 时，微凝胶的稳定透皮速率j 为0 9 8 6 0 。显 示出良好的促渗性能。 综上所述，巯基化聚乙二醇壳聚糖作为一种新型的给药系统载体材料，有良 好的释药性能、体外粘附和促渗性能。 关键词：聚乙二醇壳聚糖，巯基化，微凝胶 a b s t r a c t t h eb i o c o m p a t i b i l i t ya n da d h e s i o no fc h i t o s a n ( c s ) w i l lb ei m p r o v e db yg r a f t i n g p o l y a e t h y l e n eg l y c 0 1 c h i t o s a ni sg r a f t e db y - s h c a l li m p r o v ei t sp e r m e a b i l i t y t h e m p e g c s - s hh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dp r e p a r e di n t om i c r o g e l ，a n dt h e nw ed i da r e s e a r c ho nb i o a d h e s i v ea n dp e n e t r a t i o no fi t m a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n ： m e o p o l r a e t h y l e n eg l y c o lc h i t o s a n ( m p e g c s ) o fd i f f e r e n tg r a f t i n gr a t i o sw a s s y n t h e s i z e db ym p e ga n dc s t h eg r a f t i n gr a t i o sw e r ed e t e r m i n e dw i t ht w op h a s e s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d t h ee x p e r i m e n ti n v e s t i g a t e di n f l u e n t i a lf a c t o ro fs o l v e n t ， m a t e r i a lr a t i o ，r e a c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r e w h e nw ec o n 缸o ! t h er a t i oo fm p e ga n d c s ( m p e g ：c s ) w a s2 ：1 ，t h er e a c t i o nt i m ew a s1 8 h ，t h et e m p r e t u r ew a s3 7 ，w e p r e p a r e dm p e g c sw h i c hg r a f t i n gr a t i ow a s8 ，4 m p e g - c s _ s hw a ss y n t h e s i z e db ym p e g c sa n dm e r c a p t o a c e t i ca c i db yc a t a l y s t o fn h sa n de d c h c l t h e nd e t e r m i n e dt h ec o n t e n to f s hw i t he l l m a n sa g e n t i a w h e nw ec o n t r o lt h er a t i oo fm p e sa n dm e r c a p t o a c e t i ca c i dw a s1 ：2 w e p r e p a r e dm p e g c s s hw h i c hc a n t a i n e d - s h37 3 1pr n o l g t h em i c r o g e lw a sp r e p a r e d b ym p e g - c s s ha n dc r o s sl i n k i n go fs o d i u m t r i p o l y p h o s p h a t e ( t p p ) t h em e a nd i a m e t e ro fm i c r o g e li s 15 0 2 n mw h i c hi s d e t e r m i n e db yp a r t i c l es i z ea n a l y s i s w eu s e db s aa sd r u ga n a l o g u et od e t e r m i n et h e e ea n dl c ，w h i c hw e r e5 5 a n d6 5 d r u g si nm i c r o g e lr e l e a s e ds t a b i l yi nv a r i o u s a c o rb a la n c e ds o l u t i o n t h ea d h e s i o no fm i c r o g e lw a sd e t e r m i n e dw i t hh g m t h em i c r o g e lh a dg o o d a d h e s i o ni np h 3 0 ，6 8 ，7 4 t h em a x i m u m p r o p o r t i o no f a d h e s i o n w a s9 4 t h ep e n e t r a t i o no fm i c r o g e lw a sd e t e r m i n e dw i t hp a c l i t a x e l w h e nt h eg r a f t i n g r a t i oo fm p e gw a s8 9 7 a n dt h ec o n t e n to f s hw a s3 7 3 1u m o l g ，t h es t a b l e i n f i l t r a t i o nr a t ew a so 9 8 6 0 t h em i c r o g e ls h o w e dag o o dp e n e t r a t i o n t os u mu p ，i ti su s e da san e wa d m i n i s t r a t i o ns y s t e m m a t e r i a l ，m i c r o g e lo f m p e g c s s hi ss u i t a b l ef o rd r u gl o a d i n ga n dd r u gr e l e a s i n g t h e ya l s oh a v eg o o d a d h e s i o na n d p e n e t r a t i o n k e y w o r d s ：p o l y a e t h y l e n eg l y c o lc h i t o s a n ，s u l t h y d r y l a t i o n ，m i c r o g e i n 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 四并表示了谢意。 学位论文使用授权书 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的 全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有 关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息 服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生c 签鼽胁靳c 签鼽协融哗，t 垆 ( 注：此页内容装订在论文扉页) 武汉理t 大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章绪论 壳聚糖是一种天然的聚阳离子的亲水多糖，是自然界中来源第二大的亲水 性多糖，由甲壳素部分脱乙酰化而制成，一般把脱乙酰度在7 0 以上的称为壳 聚糖i l 】。壳聚糖具有安全、价廉、无毒副作用、良好的水溶性，生物可降解性和 生物粘附性、无抗原性、可以促进药物吸收等优点，一直作为重要的药用辅料 被广泛的使用【2 】。主要应用在以下几个方面：用于压片、制粒和包衣的辅料【3 】。 本身有一定的抗菌、抗肿瘤活性和抑制胆固醇升高，抗凝血、感染等药理活性【4 】。 作为多糖，壳聚糖有良好的血液和组织的相容性，在调节有机体代谢也起到重 要作用。对组织伤口有很好的保湿修复效果【5 】，对羟基和氨基进行化学修饰后， 可作为多肽、蛋白类等各种药物的给药载体和作为生物粘附材料、药物透膜转 运的促进剂、药物的靶向给药系统等f 6 7 】。 聚乙二醇壳聚糖是单甲氧基聚乙二醇接枝壳聚糖后的产物。在壳聚糖的氨 基上引入亲水性的单甲氧基聚乙二醇制得的微凝胶的给药系统有更长的血浆半 衰则引。单甲氧基聚7 _ , - - 醇是一种水溶性很强的链聚合物，以其低毒性、低免疫 反应性和良好生物相容性已用于药物释放系统，在生物医药学中，常用于化学大 分子的改性【9 - 1 0 1 。霍红光【i i 】等人用聚乙二醇改性壳聚糖用于固定化l 天门冬酰胺 酶，载体具有较大的通量，良好的亲水性和耐酸性，酶的固化活力较高。魏晓红 f i 2 】等人用聚乙二醇接枝壳聚糖，在溶液中通过自动的静电吸附得到聚乙二醇化 的壳聚糖d n a 自组装复合物，该复合物可用于基因转染的非病毒的载体。 p e g 接枝壳聚糖可增强壳聚糖的水溶性、生物相容性和粘附性，其自组装 微凝胶可增溶脂溶性药物，促进药物经鼻至脑的直接转运。水溶性好且无毒的 聚乙二醇( p e g ) 常用来改性天然和合成高分子，提高其生物相容性。p e g 链 是促进透过b b b 脑靶向性给药的关键基团，其机制有两点【1 3 】：提供适当的表面 特征允许载体与b b b 内皮细胞作用，从而被吸收，增强载体的长循环性能。 经p e g 表面修饰的p l g 微凝胶，表面p e g 密度较大的，可防止其在鼻粘 膜的絮聚，药物渗透率更高【1 4 1 。p e g p l a 微凝胶鼻粘膜给药在脑脊髓部位的吸 收高于静脉注射的1 7 倍l u o 6 1 。 毓基化聚合物是最广泛的具有粘附性质的聚合物大分子，它们一般都同时 武汉理j 二人学硕十学位论文 含有巯基侧链。基于巯基与二硫键的交换反应，二硫键在这种聚合物和半胱氨 酸含量丰富的子域的粘液蛋白之间形成，并生成粘液凝胶层。因此，硫代聚合 物可以模仿自然机制中的糖蛋白分泌粘液，这种粘液是一种生物系统中最常见 的结构，这本身也是价立足于粘液层形成的二硫键。 壳聚糖引入巯基，可大幅度增强其促渗性和粘附性【1 7 。1 9 1 ，巯基化壳聚糖模 拟生理分泌的粘液糖蛋白的自然机制，引入的巯基可以通过二硫化交联反应与 粘液层以共价键结合，形成的双硫键共价锚定于粘膜层。通过双硫键交换反应 或氧化过程，巯基壳聚糖与粘液糖蛋白中的半胱氨酸含量高的区域生成双硫键， 形成粘液凝胶层，从而有效地促进药物的渗透【1 7 】。凝胶毓基含量越高，粘附性 能越强，并且在缓释介质中具有更好的稳定性【1 9 1 。巯基壳聚糖微凝胶鼻腔给药 可增强茶碱抗炎症作用【2 0 1 。 高分子微凝胶是水溶性高分子经适度交联形成伸缩性三维交联网络与水组 成的多元体系，受到环境刺激的时候随之响应，是一种智能高分子材料。同时 含阳离子，阴离子活性基团的两性聚电解质微凝胶近几年来倍受瞩目，它们能 随外界环境，包括溶剂组成、p h 、盐浓度和温度的改变而产生连续或不连续的 体积相变。这种对外界环境变化十分敏感的微凝胶，即所谓的“智能微凝胶” 在高分子科学领域中已成为主要研究课题之一，因为它们在药品、医疗及相关 领域有极重要的科学研究及应用价值【2 。 1 2 聚乙二醇壳聚糖 聚乙二醇是一种用途极为广泛的聚醚高分子化合物，具有优异的生物相容 性，能够溶解于水和许多溶剂中，在体内能溶于组织液中，可被机体迅速排除 出体外而不产生任何毒副作用。更难得的是，当把p e g 和其它分子偶合时，它 的许多优良性质也会随之转移。尤其是将它接枝到蛋白质和微粒给药系统的载 体材料上时，其柔软的聚乙二醇链段能高度修饰、交替重叠覆盖在这些物质表 面，形成致密的构象云，形成立体位阻保护蛋白质和微粒不被血液中的调理素 识别、摄取，使之消除速率减慢，在血液中驻留时间延长，药物作用时i 日j 延长， 达到长循环的效果。 关于p e g 接枝壳聚糖的报道较多，p e g 改性壳聚糖有多种方法，如直接 p e g 、p e g 酸、p e g 醛、p e g 酯、p e g 丙烯酸酯等接枝壳聚糖【2 2 1 。p e g 接枝 壳聚糖可自组装成微凝胶，形成胶束增溶脂溶性药物，提高脂溶性药物的水溶 2 武汉理工大学硕十学位论文 性。p e g 接枝可增强壳聚糖季铵盐的生物相容性，p e g 接枝可降低壳聚糖微凝 胶的细胞毒性，c a c o 之细胞单层的跨模电阻不发生明显改变，并且口服p e g 接 枝壳聚糖微凝胶可增强和延长鲑鱼降钙素的吸收【2 3 1 。 p e g 接枝程度影响微凝胶的性能，p e g 化程度不一定与给药效果成正比， 微凝胶表面的p e g 链有可能妨碍微凝胶与细胞表面的相互作用【2 4 】。因此控制壳 聚糖p e g 化程度等各分子参数对于得到稳定性好、毒性低和增进药物吸收的微 凝胶很有必要。 巯基化聚乙二醇壳聚糖的合成以及微凝胶给药系统的研究，目前几乎未见 报道。壳聚糖2 位的氨基可引入p e g ，再引入巯基，提高壳聚糖的生物相容性、 粘附性和促渗性；控制p e g 接枝率和巯基化程度，调节锍基化聚乙二醇壳聚糖 亲水部分和疏水部分的比例，优化制备参数，可自组装形成微凝胶，增强脂溶 性脑瘤药物的亲水性。控制微凝胶粒径和表面电位的大小，以及微凝胶表面毓 基和p e g 的密度，可望进一步增强其粘附性和促渗性。 1 。3 巯基化壳聚糖 壳聚糖引入巯基，可增强其促渗性 2 5 - 3 0 】，巯基壳聚糖模拟生理分泌的粘液 糖蛋白的自然机制，形成双硫键共价锚定于粘膜层，通过硫醇双硫键交换反应 或氧化过程，壳聚糖与粘液糖蛋白中的半胱氨酸含量高的区域生成双硫键，形 成粘液凝胶层，从而有效地促进药物的渗透作用p 。巯基化壳聚糖微凝胶鼻腔 给药可增强茶碱抗炎症作用【3 2 1 ，微凝胶巯基含量越高，粘附性能越强，并且具 有更好的稳定性。可见，含巯基的高分子聚合物，如：壳聚糖半胱氨酸、壳聚 糖毓基醋酸等，对生物膜粘性的显著增强均与巯基的引入直接相关。 b e m k o p s c h n u c h 等 3 3 】在合成壳聚糖半胱氨酸后，从介质及释药特性的角度 对其进行了生物粘附性评价，发现其粘附性与p h 有关，酸性环境下粘附性很强， 而碱性环境时则减弱，且稳定性减小。用壳聚糖半胱氨酸制成的制剂呈零级速 率释药。a h n 等f 3 4 】对壳聚糖聚丙烯酸的高分子络合物进行了体外粘附性评价， 发现其粘附性显著增强，粘附力比卡波姆9 7 1 p n f 还要强，这解决了聚丙烯酸在 制剂中玻璃化温度高和水溶性太强的问题，对于新型生物粘附给药系统的开发 十分重要。k a s t 等【3 5 】对制备的壳聚糖巯基醋酸进行了体外评价，发现其生物粘 附性比未修饰的壳聚糖增加了近1 0 倍，同时也可生物降解，还具有良好的溶胀 行为。另外，还发现壳聚糖醋酸偶合物的生物粘附性随着偶合物中巯基含量的 3 武汉理t 大学硕十学侮论文 增多而显著增加。对用克霉吟作为模型药物制备的制剂进行体外考察时，也体 现出非常强的粘附性。在离体试验法研究中，c v e t k o v i c 等p 6 j 用肠灌注技术来观 测生物粘附片的粘附性。兔小肠中通入人工肠液，人工肠液循环方向反映了生 理性食物转运方向。蓝色的生物粘附片先放入人工肠液中水化3 m i n ，然后使其 与小肠粘液接触3 m i n ，开动蠕动泵，人工肠液的循环速度为l m l m i n 。通过半透 明的兔小肠壁观测蓝色粘附片粘附时间，粘附时间长则粘附性强。r a n g a r a o 等1 3 刁 用大鼠的胃肠粘膜来测试微凝胶的粘附性。将大鼠胃肠粘膜纵向剖开，固定在 纵向剖开的塑料管上，微凝胶均匀分布在粘膜上。将其放置在相对湿度为8 0 、 2 0 环境中2 0 r a i n ，使微凝胶与粘膜发生粘附作用。然后将塑料管4 5 度倾斜， 胃粘膜用0 1 m o l l 盐酸冲洗，肠粘膜用p h 6 0 磷酸盐缓冲液冲洗，冲洗速度为 2 2 m l m i n ，冲洗5 m i n 。冲洗下来的微凝胶数量与其粘附性成反比。 1 4 巯基化聚合物改善粘膜粘附性能的机理 细胞问的紧密连接是药物细胞问传递路径的主要障碍，它结构复杂，由一 组跨膜蛋白和细胞蛋白组成，这些蛋白不仅彼此相互作用，而且还与细胞膜和 细胞骨架有着密切的联系。细胞间的紧密连接还没有完全被认识，影响紧密连 接复合物结构的因素很多【3 8 1 。大量的实验都己证明壳聚糖对药物跨上皮粘膜细 胞的透过能力有很强的促进作用。一般认为，壳聚糖的这种作用机理是由它的 粘膜粘附性和对上皮细胞的紧密连接的调节作用综合的结果。壳聚塘的粘附机 制主要是与粘液中的糖蛋白产生非共价键的相互作用有关，如：氢键、范德华 力和离子相互作用【3 9 】。 常用高分子通常都具有粘附作用，可延长药物的滞留时问，壳聚糖及其衍 生物不仅具有优良的粘附性，而且具有促渗性，增强多肽类和抗原类药物的吸 收【4 0 啦】。壳聚糖的粘附机制主要是与粘液中的糖蛋白产生非共价键的相互作用 有关，如氢键、范德华力和离子相互作用，且粘附性随相对分子质量增大而增 强。 目前，生物粘附过程中相关价键的形成机理还不是很明确。为了更加深入 地研究生物粘附性能，了解生物粘附作用过程极其重要。这方面的研究主要集 中于分析高分子材料和组织之间形成的作用力。高分子结构特征与生物粘附作 用相关特征主要包括：( 1 ) 能够形成氢键化学基团( 例如羟基和羧基等) ；( 2 ) 粒子表面的负电性；( 3 ) 高分子的分子质量；( 4 ) 高分子链的柔韧性；( 5 ) 形 4 武汉理i ：人学硕士学位论文 成的表面压力诱导渗透进入粘液层。这些性质促使生物粘附过程中的机械力或 者化学力的形成，生物粘附性能包括以下五种原理：电子原理( t h ee l e c t r o n i c t h e o r y ) 、吸收原理( t h ea b s o r p t i o nt h e o r y ) 、润湿原理( t h ew e t t i n gt h e o r y ) 、扩散原 理( t h ed i f f u s i o nt h e o r y ) 和破裂原理( t h ef r a c t u r et h e o r y ) 。 电子理论的基础是假设生物粘附材料和粘液糖蛋白网络结构具有不同的电 子结构，基于这种假设，费米共振发生电荷转移。在界面上形成双电层，双电 层的亲和力导致生物粘附作用的形成。吸收理论认为粘附材料和胃肠道粘膜之 问的粘附力是通过范德华力、氢键以及相关的作用力形成的，目前吸附理论被 广为接受。润湿理论认为粘附材料和粘液之间的渗透以及亲密接触是产生粘附 作用的重要因素。如图所示，润湿理论主要应用于液体粘附材料，利用表面张 力促进渗透，从而产生粘附作用。扩散理论认为生物粘附材料的分子链和粘液 分子链之间的渗透和缠绕作用产生暂时的粘附作用，而且粘附作用将随着渗透 作用的增强而增强。目前通过拉伸原理测量生物粘附力最有用的理论基础是破 裂原理，它是通过分析产生生物粘附作用以后将二者分开所需要的拉力大小， 从而表征生物粘附作用。 1 4 1 巯基与粘膜凝胶层之间二硫键的形成 二硫键的是在硫醇物和粘液凝胶层之间发生，可通过巯基与二硫键交换反 应，或通过自由筑基的简单氧化过程得到，其示意图见下图。一般来说，子域 内半胱氨酸含量丰富的粘液其粘膜表面的粘蛋白很容易与巯基进行二硫键反 应。与非共价键相反，二硫键不会受到离子强度和p h 强度的影响。二硫键形成 的速度和程度取决于硫负离子的浓度。这对巯基二硫键的交换反应和氧化过程 都是有影响的。硫负离子的浓度又取决于：( 1 ) 巯基的p k a 值，( 2 ) 硫醇物的 p h 值，( 3 ) 反应介质的p h 值。l e i t n e r f 4 3 】等可以通过四种不同的方式来诠释硫 醇物与粘膜蛋白层之间二硫键的形成，包括流变，扩散，微凝胶渗透和一些特 定的粘附性能改善行为的研究。 1 4 2 原位交联过程 硫醇物对粘膜的粘附机理还有另一种可能就是它们可以进行原位交联。与 粘膜之间的渗透过程因粘附聚合物而异，在期问和之后的渗透过程中，硫醇物 本身通过与粘膜粘液凝胶层结合导致额外的锚链接形成二硫键。这种机制类似 5 武汝理】1 人学坝士学位论文 于太多数的胶粘荆的粘结机制，即渗透到粘合剂的某些表血结构之后，稳定进 入粘合剂。硫醇物表现出原位变联特性主要是依赖于巯基在生理p h 范围内的氧 化，该氧化过程可以直接导致分子内和分子键的二硫键的形成。 c 。 争耶。， o 图1 i 原位交联机理的示意图 硫醇物的原位凝胶行为可以通过流变学进行体外测量。硫醇物由液态到凝 胶的过度一般是在d h 环境变为55 后2 小时此时，高度交联已经形成。例如， 已完成在口h 值5 5 后2 小时，当高度交联凝胶形成。同时，我们发现，巯基的 含量明显减少了，这也同时说明了二硫键的形成。但是在整个研究过程中，巯 基化的壳聚糖仍然保持着未修饰的壳聚糖所表现出来的流变特性 4 4 - 5 0 l 。 这类原位交联形成的凝胶特别适合在阴道，鼻腔和眼部形成，因此也特 别适合应用于这蝗部位的粘膜层进行定位给药。 l e h n l 5 1 等发现，壳聚糖对肠粘膜、鼻粘膜有较好粘附性。以壳聚糖制各生 物粘附制剂，其粘附性受壳聚糖类型和介质条件的影响，相对分子质量大的壳 聚糖对粘膜有很好的粘附忖! 且在酸性环境下粘附力最强。j u n k o 等发现，壳聚 糖微球比其溶液对肠粘膜更具粘附性。通过壳聚糖微球对十二指肠、空肠、回 肠的粘附性比较，发现在十二指肠处的粘附最强，其次为空肠，对回肠粘附最 弱。壳聚糖溶液对小肠的粘附力较小。壳聚糖的粘附机制主要是与粘液中的糖 蛋白产生非共价键的相互作用有关，如：氢键、范德华力和离子相互作用，且 粘附性随相对分子质量增大而增强，相对分子质量增大而增强。 壳聚糖一半胱氨酸、壳聚糖一巯基醋酸具有强粘附性的原因主要是，聚合物中 的巯基通过二硫化交换反应，与粘液层以共价键结合从而与粘液糖蛋白中半 胱氨酸的于区域产生相互作剧。可见，含巯基的高分子聚合物，如：壳聚糖一半 岛p 尹 霖一 m 5 | n t j 导 岛r 銎 武汉理工人学硕十学位论文 胱氨酸、壳聚糖一巯基醋酸等，对生物膜粘性的显著增强均与巯基的引入直接相 关。 下面是大分子进行巯基化的示意图： 图： j i r + t 的h i a o n l 氆b e a 帅g 图1 2 大分子进行毓基化的示意图 h 下面是l e i t n e r 等描述的巯基化合物与粘蛋白膜表面毓基形成二硫键的示意 s w + p s s ( 9 多一s + s h s h h s 工o x 一。 三多s s 图1 - 3 巯基化合物与粘蛋白膜表面巯基形成二硫键的示意图 聚乙二醇壳聚糖具有良好的抗菌性、生物相容性，并可在生物体内完全降 解，开发成药物缓释体系极具发展潜力。聚乙二醇壳聚糖在不同的p h 环境下具 有不同的响应，其溶胀性能和药物传载性能也随着环境p h 的改变而改变。再加 上由于巯基的引入，使得巯基化聚乙二醇壳聚糖微凝胶在粘蛋白膜上粘附能力 增强，更有利于药物的释放。 7 武汉理工大学硕十学位论文 1 4 3 促渗机制 细胞间的紧密连接是药物细胞间传递路径的主要障碍，它结构复杂，由一 组跨膜蛋白和细胞蛋白组成，这些蛋白不仅彼此相互作用，而且还与细胞膜和 细胞骨架有着密切的联系。细胞间的紧密连接还没有完全被认识，影响紧密连 接复合物结构的因素很多。大量的实验都己证明壳聚糖对药物跨上皮粘膜细胞 的透过能力有很强的促进作用。一般认为，壳聚糖的这种作用机理是由它的粘 膜粘附性和对上皮细胞的紧密连接的调节作用综合的结果。 壳聚糖主要通过细胞旁路途径增加药物转运，这一结果可能与其对细胞骨 架肌动蛋白微丝的影响从而打开细胞间紧密连接有关，同时增加药物跨细胞途 径的转运，可能与其既能改变膜质流动性又能影响膜蛋自构象的特性有关，引 入巯基基团，巯基与膜蛋白形成二硫键，进一步影响膜蛋白的构象，促进药物 的转运，确切的机制尚有待研究i 5 2 】。 1 5 微凝胶 微凝胶是一种正在发展的新型功能性聚合物，在改善漆膜流挂性和机械性 能方面具有显著的优势，因此得到了越来越广泛的应用。早在1 9 3 4 年微凝胶就 由s t a u d i n g e r 等人合成。f u n k e 在微凝胶，特别是在反应性微凝胶方面做了大量 理论和实验工作，用二乙烯基苯或乙二醇二甲基丙烯酸酯的多官能单体进行乳 液聚合，制成活性微凝胶。之后人们经过多年的探索与研究，对微凝胶及其功 能和相互作用机理有了更深刻的认识。微凝胶的大小与相对分子质量的线型聚 合物相当，分予内是交联结构，与空间网状交联聚合物相似，有时其交联程度 更高。 根据微凝胶分子内部交联密度的不同，微凝胶可以分为硬质微凝胶和软质 微凝胶两类。交联密度越高，微凝胶硬度越高；反之，微凝胶越柔软，趋向于 线型聚合物。根据分子内及表面有无反应性基团，微凝胶又可以分为反应性微 凝胶和非反应性微凝胶两类，其中以反应性微凝胶的研究最为活跃，应用最为 广泛。我国相关文献报道也是反应性微凝胶居多。反应性微凝胶常见活性基团 有双键、羟基、羧基、氨基和环氧基等。 微凝胶的制备方法较多，常见的有以下几种方法：溶液聚合、乳液聚合、 微乳液聚合、无皂乳液聚合、非水分散聚合和沉淀聚合。聚合反应大多为自由 8 武汉理j ：大学硕士学位论文 基聚合，也有通过阴离子聚合制备微凝胶的方法。 单个线型大分子的分子内交联可以制备微凝胶或纳米凝胶，分子内交联可 保持分子量不变，而分子问交联使分子量增加。通过线型大分子交联制备微凝 胶或纳米凝胶的突出优点是反应体系中不存在单体，这对生物方面的应用非常 重要，因为即使是少量的残余单体也会带来潜在危害。此外，根据母体聚合物 的分子量，通过分子内交联可以获得具有不同分子量和尺寸大小的交联结构， 分子内交联和分子间交联相结合还可以合成与所选母体聚合物的分子量和尺寸 无关的纳米凝胶1 5 3 - 5 4 1 。 1 6 课题的主要内容和研究意义 聚7 , - 醇壳聚糖较之壳聚糖具有更好的水溶性、生物相容性、生物可降解 性和中性环境下的粘附性，是无毒的两性高分子聚电解质。巯基化聚乙二醇壳 聚糖具有良好的生物相溶性，可降解性和优良的生物粘附性能。巯基化程度越 高，凝胶的粘附性能越强，并且在缓释介质中具有更好的稳定性。本课题通过 控制反应条件，合成具有优良的生物粘附性，无毒的巯基化聚乙二醇壳聚糖， 另选用t p p 作为交联剂制备巯基化聚乙二醇壳聚糖微凝胶，集中探讨微凝胶的 释放性能和促渗、粘附性能，为设计新型无毒的药用高分子材料奠定基础。 壳聚糖引入巯基，可大幅度增强其促渗性，巯基壳聚糖模拟生理分泌的粘 液糖蛋白的自然机制，形成双硫键共价锚定于粘膜层。通过双硫键交换反应或 氧化过程，巯基壳聚糖与粘液糖蛋白中的半胱氨酸含量高的区域生成双硫键， 形成粘液凝胶层，从而有效地促进药物的渗透作用。巯基壳聚糖微凝胶鼻腔给 药可增强茶碱抗炎症作用，微凝胶巯基含量越高，微凝胶的粘附性能越强，并 且在缓释介质中具有更好的稳定性。 本课题的目的在于设计出巯基化聚乙二醇壳聚糖载体材料，将其制成微凝 胶，负载脂溶性抗癌药物，为经鼻至脑靶向性给药系统的研究提供一定的理论 基础。研究内容包括：合成巯基化聚乙二醇壳聚糖，有效控制各分子参数：将 不同分子参数的毓基化聚乙二醇壳聚糖制备成微凝胶，考察微凝胶的载药、释 药性能和粘附性和促渗性。 具体实验流程如下： 9 武汉理1 ：大学硕士学位论文 聚乙二醇壳聚糖 微凝胶的制备 对微凝胶进行考察，分别研究其对 药物的释放、黏附和促渗性能。 图1 4 实验设计图 本课题的关键问题如下： ( 1 ) 合成巯基化聚乙二醇壳聚糖，并将巯基化聚乙二醇壳聚糖制备成微凝胶。 控制聚乙二醇接枝率和筑基化程度，可自组装成微凝胶，又不至于包裹巯基使 其不能与粘膜相互作用，同时发挥聚乙二醇和巯基的粘附作用和促渗作用。 ( 2 ) 制备载药微凝胶，关键是微凝胶要取得较高的包封率和载药量，增强脂溶 性药物的亲水性。以牛血清蛋白为模型药物，调节制备时两相物质的浓度和质 量比，优化工艺以取得好的包封效果。以猪胃粘蛋白为模型药物，优化出具有 良好粘附性的微凝胶。以紫杉醇为药物模型，测试微凝胶的促渗性。 1 0 武汉理，l 人学硕十学位论文 2 1 引言 第二章聚乙二醇壳聚糖的合成与表征 关于p e g 接枝壳聚糖的报道较多，p e g 改性壳聚糖有多种方法，如直接 p e g 、p e g 酸、p e g 醛、p e g 酯、p e g 丙烯酸酯等接枝壳聚糖。 p e g 接枝壳聚糖的合成方法有以下几种方法： 1 n p e g 壳聚糖：先用聚乙二醇钠盐和甲基氯代醋酸酯在四氢呋喃中7 0 反应2 4 h 合成单甲氧基聚乙二醇酯。单甲氧基聚乙二醇酯醋酸水溶液与壳聚糖 以一定比例混合，7 0 反应3 天，纯化可得n p e g 壳聚糖。 2 我们用二甲亚砜和乙酸酐来氧化p e g 来制备醛基化p e g 5 5 】。先把p e g 完全溶入无水d m s o 和氯仿的混合溶剂中( 9 0 1 0 ，v ，v ) ，通氮环境下加入乙酸 酐，乙酸酐和p e g 的摩尔比为3 ：2 5 。室温搅拌1 2 小时后，用乙醚沉淀，分离， 加入氯仿，用乙醚再沉淀两次。真空干燥，得白色粉末。然后，我们用希夫碱 对壳聚糖进行烷基化反应来接枝p e g 。把醛基化p e g 和壳聚糖以摩尔比o 4 ：1 的比例加入到乙酸和甲醇的混合溶剂中( 2 1 ，v ) 。n a c n b h 3 制备的蓝色水溶 液一滴滴的加到混合液中。n a c n b h 3 和醛基化p e g 的摩尔比是0 0 2 ：0 3 ，整 个滴加过程，控制p h 在6 左右。然后先后用蒸馏水和0 0 5 t o o l 的n a o h 水溶液 透析，冷冻干燥后用丙酮除去未反应的醛基化p e g ，改变氰基硼氰化钠和醛基 化p e g 的摩尔比值，可以得到不同接枝率的产物。 3 借鉴蛋白质p g e 化常用的、反应条件温和的i ，1 羰基二眯哔活化p e g 法制备活化p e g 。参考c p e g g y 5 6 】等的方法并进行改进：将适量p e g 和c d m 溶于二氧六环一二甲亚砜( 2 ：1 ) 中，3 7 搅拌1 8 h 后，冷至室温，冰水浴中搅拌 下滴加无水乙醚沉淀产物，过滤，用冷二氧六环二甲亚砜无水乙醚( 2 ：1 ：3 ) 洗涤2 次，再用冷无水乙醚洗涤3 次，真空干燥后备用。p e g 活化反应如下： 将适量c s 与p e g c d m 溶于0 7 h c i 溶液中，3 7 搅拌1 8 h 后，冷至室温， 滴加0 5 m o l l n a o h 至p h 7 8 ，冰水浴中搅拌下滴加丙酮一无水乙醚( 1 ：2 ) 沉淀产 物，g 4 玻砂漏斗抽滤，冷水丙酮( 1 ：l o ) 适量洗涤沉淀，8 0 真空干燥后称定重 量。 对三种方法进行比较，p e g 的活化是关键，可以醛基化，酯化，醛基化p e g 较酯化容易氧化，故选择反应条件温和方法3 来合成p e g 壳聚糖。 武汉理 大学硕士学位论文 2 2 材料与仪器 2 2 1 试剂与药品 表2 1 材料 旋转蒸发器 高速离心机 集热式恒温加热磁力搅拌器 冷冻干燥机 恒温振荡器 傅立叶变换红外光谱仪 r e 5 2 a a l d 4 2 d f 1 0 1 s l g j 2 5 t h z 8 2 a n i c o l e t l7 d s x 上海亚荣生化仪器厂 北京医用离心机厂 郑州长城科工贸有限公司 宁波新芝生物科技股份有限公司 国华企业 t h e r m on i c o l e t 公司 2 3 实验方法 2 3 1 单甲氧基聚乙二醇壳聚糖( m p e g c s ) 的合成与表征 本实验采用c d m 活化m p e g 法制备活化m p e g 。c d m 活化m p e g 是借鉴 于c d m 活化蛋白质的方法，反应条件温和，易于控制。将适量m p e g 和1 ，l 羰基二咪唑( c d m ) 溶于二氧六环和二甲亚砜的混合溶剂中，二者比例为2 ： 1 ，在3 7 搅拌反应1 8h 后，自然冷至室温，然后在冰水浴中磁力搅拌，用无水乙 醚来沉淀产物，过滤，用提前预冷的二氧六坏二甲亚砜无水乙醚( 2 ：l ：3 ) 洗涤3 次，冷无水乙醚洗涤2 次，真空干燥后密封备用。 1 2 武汉理1 ：大学硕十学位论文 c 一咿h 一d 均 _ c h 3 - ( o - c h - c h 2 ) n o 一弋嚣l l l 尸y 图2 1c d m 活化m p e g 反应方程式 将0 4 9 c s 溶于0 7 h c l 溶液中，1 0 9 m p e g c d m 溶于适量蒸馏水 中，混合定容至2 0 0 m l ，3 7 搅拌1 8h 后，自然冷却至室温，滴加o 5 m o l l n a o h 至p h7 8 ，于冰水浴中磁力搅拌，用丙酮一无水乙醚( 1 ：2 ) 来沉淀产物，抽滤，然后 冷水一丙酮( 1 ：9 ) 洗涤沉淀1 次，7 0 。c 真空干燥后得到固体产物。 ( 一卫a 2 ) ，- ( ) 二渊i c i - i ，一c i - 匕- 0 ，一二t 3 图2 - 2c s 与m p e g c d m 反应方程式 2 3 2m p e g c s 接枝率的测定 m 峨一c s ) - m ( c s ) 瓣= 1 一婀o o 2 0 ( 0 ) 0 0 m p e g c s 接枝率为反应的m p e g 的摩尔数和壳聚糖上的氨基摩尔数的比。 我们通过测定未反应的游离聚乙二醇的方法间接测定m p e g c s 的接枝率。采用 y o k o y m a am 等的两相分光光度法利用游离的聚乙二醇可以把络合离子 f e ( s c n ) n 3 从水相向三氯甲烷相成正比的定向转移，然后用紫外分光光度法测 武汉理工大学硕七学位论文 定三氯甲烷相的吸光度计算游离的聚乙二醇的含量。 方法：取3 m lo 1 m o l l f e ( s c n ) n 3 ( o 0 1 m o l f e c l 3 6 h 2 0 和0 0 4 m o l n h 4 s c n 溶于1 0 0 m l 蒸馏水中) 溶液于l o m l 具塞塑料离心管中，精密吸取6 m l 三氯甲烷 和l m l 样品溶液于离心管中，制备供试品。2 5 。c 恒温振荡2 0 m i n ，3 0 0 0 r p m 离心 5 m i n ，取三氯甲烷层以1 h c i 饱和过的三氯甲烷作参照于5 0 8 n m 处测定其吸光 度。 2 3 3 全波长扫描 精密吸取l m g m l m p e g 的i h c i 溶液5 m l 于1 0 m l 量瓶中，加i h c i 至 刻度，摇匀，制备标准m p e g 溶液。精密吸取标准m p e g 溶液l m l ，按上述方 法制定测试样品，以i h c i 饱和过的三氯甲烷为空白在2 0 0 8 0 0 n m 范围内扫描， 得到其吸收光谱。可见，m p e g 样品溶液在5 0 8 n m 处有最大吸收。 c q d o 口 2 3 4 标准曲线的测定 4 0 04 5 05 0 0 w a v en u m b e r s n m 图2 - 3m p e g 全波长扫描图 分别精密吸取i m g m 1 m p e g 的i h c i 溶液3 ，4 ，5 ，6 ，7 m l 于1 0 m l 量瓶 中，加i h c i 至刻度，摇匀，制的m p e g 标准品。分别精密吸取标准m p e g l m l ， 按上述方法依次在5 0 8 n m 处测定吸光度，以吸光度a 为纵坐标，m p e g 的浓度 为横坐标制定标准曲线。得到拟合线性方程y = 1 0 2 9 x + 0 0 5 6 5 ，相关系数 1 4 武汉理t 人学硕士学位论文 r 2 = 0 9 9 9 0 ，在测量浓度范围内线性关系良好。 表2 - 3m p e g 标准品的吸收度 2 3 5 影响因素的考察 图2 - 4 m p e g 的标准曲线 本实验着重于对振荡温度和离心机转速两个重要影响因素的考察。取同一 样品6 份，其中3 份固定其它条件和振荡温度不变，让离心机的速度在2 0 0 0 r p m ， 3 0 0 0 r p m ，4 0 0 0 r p m 测定样品的吸收度。另外3 份固定其它条件和转速不变，让 振荡温度为2 5 ，3 5 。c ，4 5 测定样品的吸收度。结果如下。 表2 4 振荡温度和离心机转速考察 在2 5 。c 下恒温振荡，在3 0 0 0 r p m 的离心速率下离心，测得的吸收度重现性 1 5 武汉理t 大学硕士学位论文 和稳定性均良好。所以，确定实验的恒温振荡温度为2 5 c ，离心速率为3 0 0 0 r p m 。 2 3 6 方法学考察 2 3 6 1 稳定性考察 取供试品溶液储备液，分别在0 ，o 5 ，l ，2 ，4 ，6 h 测定吸收度，结果如下。 表2 5 供试品不同时间的吸收度 2 3 6 2 重复性考察 同时取反应样品5 份，按照供试品的制备方法制备供试品溶液。分别进行 测定，结果如下。 表2 - 6 平均接枝率的测定 结果表明，该方法重复性良好。 2 3 6 3 回收率实验 取已知含量的供试品溶液( m p e g 浓度为0 6 5 0 6 m g m 1 ) 6 份各l m l ，加入 武汉理j ：大学硕卜学位论文 等体积的m p e g 标准品溶液0 6 m g m l ，测定加样回收率。回收率( ) = 测得量 ( r a g ) 一样品量( m g ) 】力口入量( m 曲10 0 。 表2 7 回收率测定数据 结果表明，回收率在9 5 1 0 5 之间。 2 3 7m p e g c s 的红外表征 图2 - 5m p e g c s 的红外表征图谱 上图是c s 和m p e g c s 的红外图谱，可以看出1 5 9 7 c m j 是c s 氨基面内弯 曲振动峰，m p e g c s 此处的吸收峰明显减弱，说明反应主要是在氨基上面。同 时位于1 0 3 0 - - 1 2 0 0c i n 1 范围内的c s 的伯、仲醇吸收峰无明显削弱或消失，说明 c 6 和c 3 位上未发生酯化反应。 武汉理t 大学硕士学何论文 2 4 结果讨论 2 4 1 溶剂的选取 2 4 1 1 活化m p e g 溶剂的选取 根据文献报道，能完全溶解m p e g 和c d m 的溶剂有二甲亚砜，丙酮，氯 仿。能够用于沉淀m p e g c d