（茶学专业论文）乌龙茶做青工艺的相关酶学及生化机理研究.pdf

摘要 乌龙茶是中国特有的茶类，素以味醇香馥闻名于世。近年来，国内外众多研究发现， 乌龙茶具有降血压、降血糖、降低中性脂肪和胆固醇、改善高血脂症状、抗衰老、抗辐射 等药理药效作用。因此，乌龙茶的消费量逐年稳定增长。为此，深入探究乌龙茶品质形成 的生化机理，并籍此优化乌龙茶加工技术、提高乌龙茶品质和制优率，有着重要的理论及 实践意义。 本研究选用梅占、毛蟹两个乌龙茶适制品种鲜叶原料，以新工艺摇青处理为主，并设 置了2 个对照，即以不摇青处理( 室内自然摊放，处理时间与新工艺一致) 作为c k 。：在 新工艺3 次摇青的基础上加大强度摇青2 次，作为c k , ，研究了各处理过程在制品内源纤 维索酶、果胶酶( p g ) 活性及主要生化成分的动态变化，并探讨了该两类胞壁水解酶在乌 龙茶做青中的生化效应及与品质形成的关系。 纤维素酶活性动态变化趋势为：晒青后，纤维素酶活性显著上升，并继续增长至一摇、 静置后达到峰值，此后至新工艺摇青结束( 三摇、静置后) ，该酶活性以较大幅度逐渐降 低，c k , 摇青期间此酶活性持续下降。新工艺摇青与不摇青( c l 【。) 处理之间该酶活性及变 幅差异明显，但变化趋势一致。整叶与其局部问，即整叶、叶缘、叶芯之间该酶活性及变 幅有明显差别，其中在一摇、五摇时三者之间的酶活性相差较大，而在活性变化趋势上， 三者基本一致，但叶芯比叶缘更接近于整叶的变化趋势。品种闯纤维索酶活性差异显著 ( p o 0 5 ) ，毛蟹高于梅占。不同季节茶鲜叶及在制品的纤维索酶活性及变幅存在较明显 的差异。摇青各工序间该酶活性差异显著( p 0 0 5 ) ，一摇与鲜叶、二摇、三摇、四摇间 该酶活性差异显著，而与晒青、五摇间的差异不显著，说明摇青工艺的前期对酶活性的影 响较大，颇为重要。 果胶酶( p g ) 活性变化规律为：晒青后，p g 活性有小幅上升，新工艺摇青过程中，p g 活性总体为上升趋势，并在三摇、静置后达到峰值，在c k 。摇青期间p g 活性迅速下降。不 摇青处理( c k 。) 的p g 活性及变幅均比新工艺摇青处理低，但两处理的p g 活性消长趋势基 本一致。整叶、叶缘、叶芯的p g 活性及变幅有明显差别，其中在一摇、五摇时三者的p g 活性相差较大，但在变化趋势上，三者基本一致，只是叶缘比叶芯更接近于整叶。品种间 p g 活性差异极显著( p o 0 1 ) ，毛蟹高于梅占。不同季节茶鲜叶及在制品的p g 活性存在一 定的差异。摇青各工序间，p g 活性差异极显著( p o 0 1 ) ，一摇与鲜叶、晒青、二摇、五 摇之间p g 活性差异显著，而与三摇、四摇之间不显著，表明p g 的活性高峰与生化效应主 要体现在新工艺摇青期间。由此，新工艺的科学性从新的酶学机理进一步得到了证实。 纤维素酶与果胶酶( p g ) 活性之间存在显著负相关，r = - o 3 7 5 ，表明做青过程在制品 理化变化对两酶的活性产生了不同的生化效应。 纤维素酶、p g 活性与在制品含水量之间分别存在显著正相关( r = 0 4 2 5 ) 和极显著负 相关( r = - 0 4 9 3 ) 。纤维素酶活性与可溶性糖、氨基酸含量之间存在显著正相关，相关 系数分别为0 4 9 3 和0 4 2 3 ，而与水浸出物和茶多酚含量之间存在极显著正相关，相关系 数分别为0 6 8 3 和0 5 2 5 。p g 活性与氨基酸和水浸出物含量之间分别存在极显著负相关和 显著负相关，系数分别为- 0 5 5 0 和- o 4 4 2 ，表明两酶与在制品主要生化成分之间存在积极 的相互作用。 做青过程，在制品的水浸出物、可溶性糖、氨基酸、茶多酚含量总体上逐渐减少， 并随着摇青程度的加深，减幅加大。而黄酮类含量变幅较小，且在摇青工艺结束时较鲜叶 有所增加。叶芯、叶缘中的上述生化成分的变化趋势基本一致，但叶缘的物质转化幅度明 显高于叶芯。不同摇青强度下，主要生化成分的代谢程度不一。感官审评显示，新工艺摇 青的成茶品质优于强度摇青( c k 2 ) ，不摇青处理( c k 。) 的在制品，物质转化缓慢且幅度较 小，其化学因子不能形成乌龙茶特征性品质，尤其是香气品质。由此可见，做青是形成乌 龙茶品质的关键工艺。 综上可知，摇青工艺可在晒青的基础上进一步提高和积极影响两酶活性。做青的中、 前期是纤维素酶、果胶酶( p g ) 酶促作用的高峰。纤维素酶、p g 通过降解细胞壁和胞间物 质，破坏细胞壁总体结构和增加细胞间的通透性，有助于做青过程中在制品的物质转化和 水分运转。因此，合理地利用并调控胞壁水解酶的作用，无疑会对乌龙茶做青产生明显的 正效应。 关键词：乌龙茶；做青；新工艺；纤维素酶；果胶酶( p g ) ；动态变化；生化成分；机理 s t u d i e so n e n z y m a t i c a n db i o c h e m i c a lm e c h a n i s mc o r r e l a t e d w i t hr o t a t i o n t e c h n i c s ( z u o - q i n g ) o fo o l o n g t e a a b s t r a c t o o l o n g t e ai sau n i q u et y p eo ff a m o u st e ai nc h i n a , w h i c hi sk n o w n a si t ss p e c i a la r o m al i k e f l o w e r sa n df r u i t s , t a s t eo f b r i s k n e s sa n dm e l l o w n e s s i nr e c e n ty e a r s , m a n yr e s e a r c h e ss h o wt h a t o o l o n gt e ah a sp h y s i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a l f u n c t i o n so f r e d u c i n gb l o o dp r e s s u r e ，f a ta n d c h o l e s t e m ka n t i - r a d i a t i o na n da n t i - s e n e s c e n c e s ot h a tm o r ea n dm o r ep e o p l et a k ed r i n k i n g o o l o n gt e ae v e r yd a ya sag o o dw a yt ob e c o m es l i ma n dh e a l t h y t h e s et r e n d s a c c e l e r a t e c o n s u m p t i o n sa n dd e m a n d so fo o l o n g t e a b a s e do nt h e s e m a t t e r s ，d e e p e n i n g s t u d i e so n m e c h a n i s mo fc h a r a c t e rf o r m a t i o no fo o l o n gt e ab e c o m em o r ei m p o r t a n tn o w ，a n dt h e s e r e s e a r c h e sw i l lh e l pu st oe 印a n dp r o d u c t i o na r e aa n do p t i m i z et c c h n i so fo o l o n gt e af o rf u r t h e r q u a l i t yi m p r o v e m e n ta n dh i g h e rg r a d e r a t i oo f o o l o n gt e ap m d u c l i o n s f r o my e a r1 9 8 7 t o1 9 9 3 ， a f t e ras e r i e so f r e p e a t e dt r i a l s p r o f c s s o ry a n g w e i - l iw i t hh e rc o - w o f l r si n s t i t u t e dn e wt e c h n i c s o fo o l o n gt e a , w h i c hw a sa v a i l a b l eo fu s i n gl o c a lt e av a r i e t i e so fh u n a np r o v i n c et op r o c e s s o o l o n gt e a c o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a lt e c h n i c so f o o l o n gt e a , n e w t e c h n i ss a v e s1 2 - 2 3r a t i oo f t i m ed u r i n gr o t a t i o ns t a t e , w h i c hi n c l u d e s3t i m e so fs h a k i n gp r o c e d u r e sa n ds p e n d sa b o u t6 h o u r s r o t a t i o nt e c h n i c s , s p e l l e da sz u o q i n gi nc h i n e s e i st h ek e yp r o c e d u r ei np r o c e s s i n go f o o l o n gt e a , a n dp l a y s av e r yi m p o r t a n tr o l ei na r o m aa n dt a s t ef o r m a t i o no f o o l o n gt e a r o t a t i o n t e c h n i c si n c l u d e sw i t h e r i n ga n ds h a k i n gp r o c e d u r e s , s p e l l e da ss h a i - q i n ga n dy a o - q i n gj n c h i n e s er e s p e c t i v e l y i nt h i sf e s e a r c h ，t w ov a r i e t i e so ft e at r e en a m e dm e i z h a na n dm a o 姬ew c r c s e l e c t e d , a n df r e s ht e al e a v e sb et r e a t e dw i t hn e wt e c h n i c so fo o l o n gt e a b e s i d e s , t w oc o n t r a s t s w e r ea r r a n g e d , n a m e l y , a f t e rf r e s ht e al e a v e sw i t h e r e du n d e rs u n l i g h tf o r1 5 - 3 0m i n u t e s , t o o k s o m et e al e a v e st r e a t e dw i t hn os h a k i n go p e r a t i o na n dm a d et h i sa sc o n t r a s tn o 1 ( c k l ) w h e n f i n i s h e ds h a k i n gp r o c e d u r e so fn e wt e c h n i c s ，w h i c hi n c l u d e s3t i m e so f s h a k i n go p e r a t i o n , t a k i n g s o m et e al e a v e st ob es h o o k2t i m e ss e q u e n t i a l l ya n dm a k et h a ta sc o n t r a s tn o 2 ( c k 2 ) t h e n s t u d i e dd y n a m i cv a r i a t i o no fe n d o g e n o u sc e l l u l a s e ( c e ) p o l y g a l a c t u r o n a s e ( p g ) a c t i v i t ya n d m a j o r b i o c h e m i c a l c o m p o n e n t s o f b e i n gp r o c e s s e d t e al e a v e s d u r i n g 3t r e a t m e n t s a b o v e m c n t i o n e d t r i a l sr e s u l t sw i l lb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： a f t e rw i t h e r i n gp r o c e d l l r e ，t h ec e a c t i v i t yi n c r e a s e sr a p i d l y , a n dk e e p s o n i n c r e a s i n gu n t i l r e a c h e st h ep e a kv a l u ea tf i n i s ho f1 s ts h a k i n g b u ti nt h es t a t ea f t e ri s ts h a k i n g ，i n c l u d e st h e2 n d ， 3 r d ，4 t hs h a k i n g ，c ea c t i v i t yd e c l i n e sg r a d u a l l y c ea c t i v i t ya n di t sc h a n g eb r e a d t ho fc k la r e l o wt h a nt h e s eo fn e wt e c h n i s ，b u tv a r i a t i o nt r e n d so fc e a c t i v i t yi nt h e s et w ot r e a t m e n t sk e e p i i i u n a n i m o u s t h e r eh a so b v i o u sv a r i a n c eo fc ea c t i v i t y a m o n gw h o l el e a f , l e a f - e d g e a n d l e a f - c e n t e r ，b u tt h e yk e e p t h es a m ev a r i a t i o nt r e n d so f a c t i v i t y a tt h e1 s ta n d 5 t h s h a k i n gc o u r s e ， t h e r eh a sg r e a t e rv a r i a n c eo fc ea c t i v i t ya m o n gw h o l el e a f , l e a f - c e n t e ra n dl e a f - e d g e c e a c t i v i t yf i n i s h e si t s a c t i v a t i o n d u r i n gs h a k i n gp r o c e d u r eo fn e wt e c h n i c s s t a t i s t i c a la n a l y s i s s h o w st h a tt h e r eh a ss i g n i f i c a n tv a r i a n c eo fc e a c t i v i t yi nd i f f e r e n tt e av a r i e t i e s ( p o 0 5 ) c e a c t i v i t yo fm e i z h a nv a r i e t yi sl o wt h a nt h a to f m a o x i ev a r i e t y b e s i d e s ，m u l t i p l ec o m p a r i s o n s r e v e a lt h a tt h e r ea r e s i g n i f i c a n tv a r i a n c e s o fc ea c t i v i t y a m o n gv a r i o u ss h a k i n gp r o c e d u r e ( p o 0 5 ) ，c ea c t i v i t yo f 1 s ts h a k i n gh a ss i g n i f i c a n tv a r i a n c ew i t ht h a to f f r e s h n e s s ，t h e2 n d , 3 r d a n d4 t hs h a k i n g t h ev a r i a t i o no fc o n t a i n i n gw a t e ri nt e al e a v e sd u r i n gr o t a t i n gc o u r s eh a s s i g n i f i c a n tp o s i t i v el i n e a rr e l a t i o n s h i p ( p x 4 ，儿茶素( x 2 ) 、黄酮类( x 3 ) 和( 氨基酸+ 可溶性糖) j l 茶素( x 9 ) 对品质有直接负效应，其效应大小顺序为x 3 x 9 x 2 。氨基酸和儿茶素对品质存在较强的 间接芷效应。郭雅铃等【掣j ( 1 9 9 4 1 9 9 6 ) 系统研究了做青中茶梢水分状况及水势变化与乌 龙茶品质之间的联系，发现晒青叶水分状态因减重率和季节而变化，当晒青叶水势下降 至2 0 6 m p a 时不能正常做青，做青方式主导水势变化趋势。同时认为水分参与各种生理 过程和生化反应，引起水势变化的内在原因主要是膨压和细胞液浓度的变化，茶梢在失 水状态下，体内水分的动态平衡的形成，使得水分作为溶媒和溶剂，牵动一系列叶内反 应。黄福平等【1 u j 研究了做青强度对青叶腊质过氧化作用和茶叶品质的影响，表明摇青和 自然萎凋均能促进丙二醛( m d a ) 积累，在做青前期适当晒青和轻摇可以提高s o d 活 力，重摇降低s o d 活力，进而0 2 。产生速率加快，脂质过氧化加速，促进青草味化合物 散失，乌龙茶特征香气提高。 1 1 2 乌龙茶香气组成及形成机理 在香气研究方面，开始是研究乌龙茶成茶的香气组成及含量，如吴秋儿i “j ( 1 9 8 6 ) 、 骆少君等【1 z j ( 1 9 8 7 ) 均对闽南、闽北乌龙茶成茶的香气成分进行了分析，并认为不同做 青工艺能形成不同的特征香日本学者也较多地开展了这方面的研究。戴素贤等i 1 3 d 7 j ( 1 9 9 0 1 9 9 8 ) 系统地研究了地域、做青工艺、品种特性对广东乌龙茶香气组成及含量的 影响。此后，香气研究逐渐深入，由成茶转向在制品香气动态变化研究。王日为等【m 】 ( 1 9 9 9 ) 研究了做青过程乌龙茶香气动态变化，郭玉琼等【1 叫( 2 0 0 0 ) 研究了不同环境做 青过程乌龙茶的香气形成。张方舟等p u j 探讨了不同湿度做青环境对乌龙茶香气的影响。 1 1 3 品种适制性、培育措施、做青微域环境调控对乌龙茶品质的影响 赖明志【2 1 】研究了适制乌龙茶品种的田间光合特性，发现三倍体良种梅占的净光合速 率最高，而光饱和点和胞间二氧化碳浓度最低，林金科等【2 21 发现适制乌龙茶品种茶树具 有类似的叶绿索吸收光谱，张杰等矧、杨伟丽等畔】报道了适制乌龙茶品种的特殊性状和 非乌龙茶产区茶树品种的适制性，张应根等瞄】( 2 0 0 0 ) 研究了适度遮荫对夏暑乌龙茶叶 片结构的影响，林学诗【拍】( 1 9 8 9 ) 、刘用敏阳( 1 9 9 1 ) 都探讨了做青微域环境( 温、湿 度) 对乌龙茶生化成分及品质的影响，金心恰等【拈捌从做青间气流因子、通风技术、做青 环境自动控制、蔡金福等刚( 2 0 0 0 ) 从人工控温、控湿等方面研究了乌龙茶加工技术对 品质的影响。 1 2 茶叶加工中的酶学研究及应用 茶叶加工中研究得比较多的酶主要有水解酶类和氧化还原酶类，如多酚氧化酶、过 氧化物酶、超氧化物歧化酶、果胶酶、纤维素酶、糖苷酶、蛋白酶和淀粉酶等。茶叶加 工实质是生物化学和物理化学的过程，其主要技术环节都与酶的控制和利用有关【3 ”。酶 学作为生物化学的一个重要分支学科，近年来得到了迅速发展，这也推动了与茶叶加工 2 相关的酶学研究。 1 2 1b 一葡萄糖苷酶 自然界许多植物籽实内部存在1 3 葡萄糖苷酶。b 葡萄糖苷酶是将茶鲜叶中香气前体 物质糖苷转化为游离态香气的关键酶【3 2 】。茶叶中糖苷酶的研究开始于8 0 年代初期， t a k e o t 【3 3 l ( 1 9 8 1 ) 在去除了挥发物的蒸青茶鲜叶匀浆中加入外源b 葡萄糖苷酶共同培 养，结果检测到有芳樟醇和香叶醇生成。此后，他在将茶鲜叶匀浆物置4 0 c 下培养 3 0 m i n 后得到了同样的结果。当加入该酶的抑制剂h g + 和特异性抑制剂葡萄糖酸- 1 ，4 - 内酯 后，芳樟醇和香叶醇的生成受阻。据此，他推测茶叶中芳樟醇和香叶醇的形成与内源b - 葡萄糖苷酶有关。随后，此类研究进一步开展。f i s c h e rn 等p 4 ( 1 9 8 7 ) 用外源1 3 - 葡萄糖 苷酶及果胶酶水解红、绿茶，产生大量香气物质。y a n om 1 3 5 1 等( 1 9 9 0 ) 以对硝基苯b d 葡萄糖苷为底物，同茶叶粗酶提取物共同培养后，测出每1 0 0 克茶鲜叶中含有2 0 8 个活 性单体的葡萄糖苷酶。这不仅支持了此前t a k e ot 的推测，也首次证实茶叶中含有参 与香气释放的1 3 葡萄糖苷酶。之后，s a k a t ak 等p 6 l ( 1 9 9 3 ) 将茶鲜叶粗酶提取物纯化后也 得到6 d - 半乳糖苷酶和b 葡萄糖苷酶。b 半乳糖苷酶广泛存在于植物中，并参与植物 细胞壁多糖及阿拉伯半乳聚糖的降解。此后，对1 3 葡萄糖苷酶的研究逐步深入。董尚胜 等1 3 7 】( 1 9 9 8 ) 试验证明茉莉花中的b d - 葡萄糖苷酶能催化生成芳樟醇，并初步判断其等 电点在8 7 9 0 ，其单体蛋白分子量在3 5 3 8 k d 之间。夏涛等【3 2 l ( 1 9 9 8 ) 研究了红茶萎凋 过程中b 葡萄糖苷酶活性的变化动态，结果表明：在萎凋期间，酶活性是逐步增强的， 其活性可达鲜叶的2 - 2 5 倍，且受萎凋温度和萎凋程度的影响；而在发酵过程中该酶活性 迅速下降，且发酵温度越高，其活性下降越大。据此他认为低温萎凋和发酵有利于酶活 性的提高和香气的形成。张秀云等( 1 9 9 9 ) 采用不同做青工艺，对福鼎大白茶和槠叶 群体种两品种萎凋做青过程中b 葡萄糖苷酶活性的变化进行了研究结果发现，萎凋做 青期间酶活性呈双峰变化趋势，做青结束前约2 h 达整个做青过程的最大值；重做青比轻 做青酶活性高，槠叶种比福鼎大白茶的酶活性高。并认为在不同的茶区应采用合适的做 青方式，才能充分发挥乌龙茶的特征性香气。骆耀平等【，9 】对适制红茶、绿茶、乌龙茶的7 个茶树品种新梢中b 葡萄糖苷酶的活性进行了研究。结果发现，7 个品种间的b - 葡萄糖 苷酶活性差别甚大，高低之差达3 4 倍。同时，新梢不同叶位的酶活性是：芽 第1 叶 第2 叶 第3 叶 茎梗，随叶龄的增加该酶活性趋于减弱，但有的品种呈先降后升的变 化。 b 葡萄糖苷酶活性的测定方法也在不断发展。王华夫等【4 0 】以对硝基苯基b d 葡萄 糖苷( p n p g ) 为底物，研究了茶叶中b 葡萄糖苷酶的活性，并建议选择4 0 0 r i m 测定其 吸光度。江昌俊等 4 1 , 4 2 】研究了从茶树鲜叶提取b 葡萄糖苷酶时不溶性聚乙烯吡咯烷酮 ( p v p p ) 的加入量、缓冲液的选择和多酚类浓度等对酶活性的影响及酶的部分特性。结 果表明：加入与鲜叶重量相等的p v p p 可获得较高的酶活性，选用浓度为o 1 m o l l ( 离子 强度为0 7 ) 的柠檬酸钠缓冲液可获得较高活性的酶液；浓度仅为4 m g l 的茶叶多酚类物 质能使酶完全失活；1 3 一巯基乙醇和e d t a 对酶活性有抑制作用；而甘油能提高酶活 性，且2 2 5 m o 坍的甘油效果较明显；n a c l 对酶活性几乎没有影响。 舒爱民1 4 3 1 研究了1 3 葡萄糖苷酶的固定化及其性质，发现b 葡萄糖苷酶经壳聚糖固定 化后，酶促反应的最适温度从4 0 ( 3 提高到5 0 c ，高活性的温度范围相应增大( 4 0 6 0 ) ；酶促反应的高活性p h 范围也加宽( 5 o 石5 ) ；室温条件下储存酶活力稳定性得当极 大改善。这些性质的改善将有利于酶制剂应用于饮料生产实践，对利用1 3 葡萄糖苷酶水 解释放茶叶饮料中的香气成分，改善茶饮料的风味和品质尤其有利。 1 2 2 1 3 一樱草糖苷酶 茶叶中含有多种糖苷酶。m o n a 等1 4 4 1 ( 1 9 9 4 ) 将茶鲜叶中制备的粗糖苷物质分别 同四种酶制剂共同培养，实验结果显示，1 3 葡糖苷是茶叶中香气前体的主要存在形式； 糖苷酶和茶鲜叶丙酮粉处理后，释放的香气物质量几乎是b 葡萄糖苷酶处理的2 - 3 倍， 这说明茶叶中香气前体除了葡糖苷形式外，还以其他单糖苷、双糖苷或寡糖苷形式存 在，相应参与香气释放的内源酶也具有多样性g u ow 等f 4 5 1 、o g a w a k 等 4 6 1 及y a s u y u k i l j i m a 等1 4 7 1 分别从薮北种、水仙种及阿萨姆种茶鲜叶粗酶提取物中经层析纯化得到1 3 樱草 糖苷酶，进一步探明了参与香气释放的内源酶系o g a w a k 1 4 5 】用中国水仙和毛蟹品种制成 乌龙茶，提取其粗酶和香气物质，测定了樱草糖苷酶的活性及其特性。测得其分子量分 别为6 1 k d 和6 0 3 k d ，其等电点为9 5 ，最适温度为4 5 c ，最适p h 为4 0 。该酶在4 5 以下，p h 3 0 5 0 时表现稳定。将该酶与糖苷结合的前体反应时，检测到芳樟醇及其氧化 物、香叶醇和a 苯乙醇等物质。因此，茶叶中的b 樱草糖苷被认为是香气形成的主要底 物。 1 2 3 蛋白酶和淀粉酶 蛋白酶可将茶叶中的蛋白质水解成各种氨基酸，不仅能改善茶叶的香气和鲜爽度，而 且可减少不溶性的复合物产生，提高茶汤的质量。据曾晓雄报道娜】，在红碎茶加工时添加 适量蛋白酶可使其氨基酸含量提高，茶红素含量提高2 1 5 以上，茶褐素比例明显下降， 使制得的红碎茶滋味增强且更显醇和，汤色变亮，粗青气减少，香气变好。王若仲等1 4 9 , s o l 研究了乌龙茶加工中蛋白酶、淀粉酶活性与相关生化成分的变化，指出：在萎凋过程中， 蛋白酶、淀粉酶活性明显提高，在做青过程中两者的变化趋势基本一致；酶活性在二摇静 置后达到峰值，随后逐步下降。淀粉酶的变幅小于蛋白酶。两酶在整叶、叶缘、叶芯中呈 现各自的变化规律。淀粉含量、在制品p h 均与淀粉酶活性呈显著负相关，蛋白酶活性与 4 p h 之间亦有显著相关性。两酶的最适p h 、温度等条件接近，相互间消长关系达显著水 平。在乌龙茶新工艺加工过程中，尽管蛋白水解酶不能使氨基酸和可溶性蛋白在量上有较 多的积累，但是就其进一步参与各种反应、转化形成一系列芳香物质来看，蛋白酶对乌龙 茶特有品质的形成，尤其是其香昧的发挥起着十分重要的作用。 1 2 4 纤维素酶和果胶酶 纤维素酶和果胶酶属于多糖水解酶类，可催化纤维素和果胶物质水解成小分子的糖 类物质。纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，目前发现纤维素酶中有三类性质不同的 酶，即外切b 1 ，4 - 葡聚糖酶( c l 酶) 、内切b 1 ，4 - 葡聚糖酶( c x 酶) 和1 3 葡萄糖苷 酶。h o b s o n 5 2 1 ( 1 9 6 8 ) 在番茄完熟突变体果实中曾发现纤维素酶的四种组分，其中两种是 内切纤维素酶，一种是非特化的聚b 葡萄糖酶，一种是作用于纤维二糖的酶。果胶酶也 是多种酶的总称，植物中的果胶酶包括原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶( p g ) 和果胶酯酶 ( p e ) 、果胶裂解酶( p l ) 。多数研究结果表明 5 3 - 5 5 1 ，果胶酯酶( p e ，e c3 1 1 1 1 ) 对果 胶的增溶没有直接作用，该酶的主要功能在于催化脱除半乳糖醛酸羧基上的甲醇基，从 而有利于p g 分解多聚半乳糖醛酸链，为多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 作用提供底物。多聚 半乳糖醛酸酶( p g ) 的作用一直被认为是分解果胶质面引起果实软化1 5 6 1 。p g 有内切和外 切两种，外切p g 使多聚半乳糖醛酸从链端逐个开始水解，而内切p g 则从分子中间割断 多聚半乳糖醛酸链。内切p g 降解果胶物质的作用力比外切p g 强。如有研究发现，离核 桃品种兼有高活性的内切和外切p g ，果实软化快，成熟过程中可溶性果胶含量明显上 升；粘核桃品种只有外切p g ，成熟过程只有细微软化和很少量的果胶溶解1 5 5 1 。p r e s s e y 和a v a n t s l 5 7 从桃果实中分离出内切p g ( c n d o p g ，e c3 2 1 1 5 ) 和外切p g ( e x o p g ，e c 3 2 1 6 7 ) 。内切p g 沿半乳糖醛酸链随机水解糖苷键，导致果胶链变短、分子量下降。其 适宜d h 为4 0 ，二价离予不影响其活性。外切p g 则从非还原性末端水解单个半乳糖醛 酸，其适宜的p h 为5 5 ，并以钙离子为活化剂。但是，不同植物中的p g 的性质存在差 异，也有不少研究表明，钙离子能较强地抑制某些植物组织中的p g 活性 s s 枷】。 目前有关纤维素酶和果胶酶在植物上的研究，主要集中在果树生理落果和果蔬采后 生理上f 6 1 侧，并认为纤维素酶、果胶酶( p e 、p g ) 是促使果实胞壁降解和果胶质增溶并 由此引起果树生理落果、采后果实成熟软化的主要水解酶类。b e n - a r i e 认为只有一种纤 维素酶和p g 的混合物，才能使未完熟梨组织转变得近乎自然完熟 6 4 】。目前，该两类酶 在茶学上的研究及应用多见于外源纤维素酶和果胶酶制剂在茶叶加工和茶饮料生产中【6 5 删，而内源纤维素酶和果胶酶在茶叶加工中的研究还极少见报道。 5 2 本研究的目的、意义及主要研究内容 2 1 目的、意义 从以上论述可知，目前有关乌龙茶加工技术及理论的研究主要集中在工艺优化、品 种与工艺的关系、加工中在制品香气、滋味成分的组成与变化、做青中的水分效应等方 面，而对于乌龙茶做青的生化机理的深入研究，还有待进一步加强。众多研究表明，乌 龙茶加工中所发生的复杂生化变化，其主要根源在于在制品的内源酶所引发以多酚氧化 酶的酶促反应为主的系列反应。近年来，内源水解酶在促进茶叶香气形成中的重要作 用及其反应机理，受到了茶学及相关学科的关注，国内外对此作了较深入的研究，但有 关乌龙茶做青的酶学机理的研究还比较少。禹利君等吲( 1 9 9 8 ) 、王若仲等 4 9 5 0 l ( 1 9 9 9 ) 在杨伟丽、何文斌等【5 1 l 研发的乌龙茶新工艺( 1 9 8 7 1 9 9 3 ) 的基础上分别研究了多酚氧化 酶( p p o ) 、过氧化物酶( p o d ) 、淀粉酶和蛋白酶在乌龙茶加工中的活性动态变化及相关 生化成分的消长规律。本研究是在此基础上的续题( 湖南省教育厅下达的课题) ，通过 研究乌龙茶做青过程在制品内源纤维素酶和果胶酶( p g ) 的活性及主要生化成分的动态 变化规律，及其相互变化的内在联系，并结合成茶品质感官审评，探求做青工艺中纤维 素酶和果胶酶的生化效应、在制品的物质代谢方向，及其对乌龙茶品质形成的影响。以 进一步完善乌龙茶新工艺理论，为因地制宜地发展新的乌龙茶产区、提高乌龙茶品质提 供理论依据。 2 2 主要研究内容 2 2 1 新工艺摇青、不摇青处理与强度摇青过程在制品内源纤维索酶、果胶酶( p g ) 活 性动态变化； 2 2 2 纤维素酶、p g 活性变化与在制品的主要生化成分消长之间的相关性； 2 2 3 纤维素酶、果胶酶( p g ) 在乌龙茶新工艺做青中的理化效应探讨； 2 2 4 不同摇青处理下在制品主要生化成分的动态变化及其与成茶品质的内在联系。 材料与方法 1 供试材料及试验处理 1 1 供试材料 2 0 0 2 2 0 0 3 年4 月，选用湖南农业大学品种园的乌龙茶适制品种梅占和毛蟹的鲜叶为 原料，进行本试验的各项内容研究。采摘标准以中开面2 3 叶为主，每次重复各品种鲜叶 2 0 k g 左右。试验重复5 次。 1 2 试验处理 本试验研究设三个处理，即在鲜叶原料经晒青、摊凉后取一部分按新工艺进行摇青， 另取一部分作不摇青处理，于室内( 做青间) 自然摊放，此为对照1 ( c k l ) 。新工艺的摇 青共进行3 次，历时6 7 l l ，分别为：一摇2 - 3 r a i n ，静置3 0 r a i n ；二摇4 - 5 r a i n ，静置l h ： 三摇8 - 1 0 r a i n 。静置3 h 。c k l 的处理时间与新工艺一致。在新工艺摇青结束后，取其中一 部分在制品继续摇青2 次，历时6 8 h ，即四摇1 2 - 1 5 m i n ，静置2 5 - 3 h ；五摇1 6 - 1 8 m i n ， 静置3 4 h ，以观察摇青强度和时间对纤维素酶和果胶酶( p g ) 活性的影响。此为对照2 ( c ) 。做青间的环境条件为：温度2 3 2 5 x 2 ，相对湿度8 5 3 。在制品杀青后经初 揉、初干、复揉、足干( 分2 次进行) 等工序制成成茶。试验设计如下图所示； 鲜叶卜晒青( 1 5 3 0 m i n ) 卜凉青( 1 0 2 0 m i n ) 厂 摊放( c k l ) 杀青 新工艺摇青 初揉、初干 复揉、足干 青( c k d 7 1 3 取样及固样方法 在鲜叶、晒青及各次摇青、静置后分别取在制品及对照样的第二叶，即整叶，并在 摇青期间分取整叶、叶缘和叶芯进行纤维素酶、果胶酶( p g ) 活性及含承量测定，并另 进行冷冻( 2 0 ) 固样，作为生化成分分析用。将整叶( 第二叶) 用不锈钢剪刀剪下叶 片边缘约2 - 3 m m 宽度作为叶缘样，余下的为叶芯样。c k l ( 不摇青处理) 只取整叶样作 酶活性及生化成分分析，取样方法和时间与新工艺同步进行。 2 主要药品及仪器设备 果胶粉( s i g m a ) 、聚乙烯吡咯烷酮( p v p p ，s i g m a ) 、3 ，5 二硝基水杨酸 ( d n s ) 、冰醋酸、无水乙酸钠、苯酚、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、氯化钠、硫酸。 v i s 7 2 2 0 可见分光光度计、l d z 4 0 8 离心机、夏普冰箱( b c d 2 5 4 ) 、电热鼓风干燥 箱、恒温水浴锅、f a l l 0 4 电子天平、手工摇青机、微波炉等。 3 检测内容与方法 3 1 检测内容 3 1 1 乌龙茶新工艺做青过程在制品内源纤维素酶、果胶酶( 阢) 活性 3 1 1 1 整叶的纤维素酶、p g 活性测定 在鲜叶、晒青、一摇、二摇、三摇静置后，取在制品的第二叶作为整叶样，分别按 3 2 1 、3 2 2 所述方法制各粗酶液，备用。 3 1 1 2 叶芯、叶缘的纤维素酶、p g 活性测定 在一摇、二摇、三摇静置后，取在制品的整叶( 第二叶) 用不锈钢剪刀剪下叶片边 缘约2 - 3 r a m 宽度作为叶缘样，余下的为叶芯样，分别按3 2 1 、3 2 2 所述方法制备粗酶 液，备用。 3 1 2c k ，处理过程纤维素酶、果胶酶( p g ) 活性测定 在新工艺3 次摇青静置后取样的同期，取c k ，处理下的在制品第二叶，分别按 3 2 1 、3 2 2 所述方法制备粗酶液，备用。 3 1 3c k 摇青过程纤维素酶、p g 活性测定 在四摇和五摇静置后取在制品第二叶( 整叶) ，并按3 1 1 2 所述方法从整叶上分别 取得叶缘、叶芯样，分别按3 2 1 、3 2 2 所述方法制备粗酶液，备用。 3 1 4 新工艺与c k l 、c k 2 处理过程在制品含水量测定 取样步骤及方法与各处理酶活性测定取样一致，取样后及时测定。 3 1 5 新工艺与o k ，、o k , 处理过程在制品主要生化成分含基测定 主要生化成分包括水浸出物、茶多酚、氨基酸、可溶性糖和黄酮类等。取样方法与 各处理的酶活性测定取样一致，取样后先进行2 0 冷冻固样，待测。 3 2 检测方法 3 2 1 纤维素酶的粗酶液制备 取样约0 6 9 ，用不锈钢剪刀剪碎，加入预冷的醋酸缓冲液( p h 4 8 ，内含 1 5 p v p p ) 5 m l ，迅速匀浆l r a i n ，再加醋酸缓冲液5 m l ，置冰箱中( 4 ) 提取2 4 h 。然 后室温下( 1 7 2 0 ) 离心1 0 m i n ( 4 0 0 0 r r a i n ) ，留上清液，即得粗酶液。 3 2 2 陷的粗酶液制备 取样约0 6 9 ，加预冷的0 1 5 m o l l 的n a c l 缓冲液( p h 6 0 ，内含1 5 p v p p ) 5 m l ， 迅速匀浆l m i n ，再加5 r a ln a c i 缓冲液，置冰箱中( 4 ) 提取2 4 h 。然后室温下( 1 7 - 2 0 ) 离心1 0 r a n ( 4 0 0 0 r r a i n ) ，留上清液，即得粗酶液。 3 2 3p g 活性测定 采用3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 定糖法 7 0 7 1 1 。取0 5 m l 酶液，加预热的0 2 5 的果胶液 ( p h 3 8 ) 2 m l ，对照先加2 m l d n s 液破坏酶活性。置