生化药物开发中科院微生物所钞亚鹏.ppt

生化药物的开发,基因工程技术生产L-天冬酰胺酶药物唾液酸、唾液酸衍生物的研究、开发、应用酶法制备低分子量肝素药物,钞亚鹏钱世钧中国科学院微生物研究所2006年月,项目1:基因工程技术生产抗白血病药物L-天冬酰胺酶,L-天冬酰胺酶在临床上已使用三十余年，但在治疗白血病方面，该酶仍被认为是一个有效的药物。应用中存在的问题：作为异体蛋白的酶的长期使用会刺激免疫系统，对人体产生有害的免疫排斥反应；酶在人体中的不稳定性，半衰期短；更为重要的是，菌种产酶活性低而引起酶制剂成本太高，一般病人根本承受不起，这些问题不解决，就会大大限制酶的广泛使用。解决途径：通过现代育种技术，基因工程的方法来提高菌种产酶能力，是克服酶在应用中的缺陷一个最有力的途径。,本实验室工作基础,我们实验室在1970年筛选出一株高产天冬酰胺酶的大肠杆菌，酶活力达4.6IU/ml，经过工厂中试、酶制剂纯化、动物、临床试验，于1973年通过鉴定，在天津生化制药厂获准生产，在医院里得到了应用。在八十年代末，由于酶活力低、成本高等原因，该厂停止了生产该酶。,工作进展,用PCR技术从染色体DNA中钓取酶的基因，并将其转入原始生产菌株，成功构建工程菌。通过发酵条件优化试验，该菌产酶能力达到120-150U/ml,发酵液最高可超过200U/ml以上，比原生产菌株提高30-50倍。酶蛋白占菌体可溶性蛋白的50%左右。酶的纯化步骤将比原来的工艺简单有效。该工程菌稳定性好，培养50代以上，重组质粒仍保留90%以上。中试规模上纯化了该酶，纯度达到以上。,开发目标,大规模生产较低成本的L-天冬酰胺酶药物，满足国内临床需求,项目:唾液酸、唾液酸衍生物的研究、开发、应用,唾液酸是一族神经氨酸衍生物，是一个含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，唾液酸的应用：唾液酸具有阻碍病原体附着在细胞上以及使细胞产生免疫抗体作用;作为食品添加剂，适合用于婴儿断奶食品及住院患者营养品；作为药物，对于中心或外周性神经疾病以及脱髓鞘病有疗效；以它为原料，能开发一系列重要糖药物，在抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、治疗老年性痴呆症上均有非常好的效果。原料药、药物中间体、保健品添加剂,存在问题,唾液酸用处很大，但它的来源有限，一般从蛋清、牛的初乳、动物组织的粘蛋白中分离，难以大量制备，因此价格昂贵。虽能用化学方法合成唾液酸，但需复杂的基团保护和脱保护措施。而现在已能用微生物直接发酵和生物合成方法成功制备唾液酸。,工作进展,科学院微生物所已筛选到一株优良的产多聚唾液酸的菌种，完成了培养条件试验，进行了发酵中试（200L罐）；并完成了多聚唾液酸制备以及进一步水解成单体唾液酸及纯化试验；在小试规模上获得成功；合成了唾液酸胆固醇衍生物。,开发目标,在中试规模上微生物发酵法生产高纯度唾液酸单体,项目:酶法制备低分子量肝素药物,定义:平均分子量低于8000Da的硫酸化葡糖胺聚糖的盐；克服肝素临床使用过程中带来的副作用；低分子量肝素的主要优势表现在:1.抗血栓作用优于肝素，而抗凝活性低于肝素；2.生物利用度高；3.体内半衰期长;4.出血倾向小；5.口服易吸收。,试验进展,获得一株产生肝素酶的新菌株,并进行了肝素酶的纯化、酶学性质、催化专一性等工作;确定了肝素酶裂解肝素制备低分子量肝素的条件,并制备了具有抗平滑肌细胞增生活性的肝素寡糖;在寡糖纯化、结构分析、寡糖蛋白相互作用方面做了大量基础工作通过对寡糖的药理学研究，明确了酶法得到的肝素寡糖的抗