（药物分析学专业论文）一些苯乙烯代谢物的检测和它们的毒性作用研究.pdf

一些苯乙烯代谢物的检测和它们的毒性作用研究 专业：药物分析学 研究生：沈水杰 导师：曾苏 摘要 苯乙烯( s t y r e n e ，c a s ：1 0 0 4 2 5 ) 是塑料橡胶工业的重要原料，苯乙烯可 发生聚合反应生成聚苯乙烯，或与其他单体原料形成共聚物，用以制造各种塑料 树脂，合成橡胶。含有苯乙烯的塑料橡胶制品广泛用于日常生活和工业生产，如 各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯每年产量 巨大，全球产量达3 0 0 0 多万吨，我国2 0 0 5 年产量达1 2 5 万吨。苯乙烯还存在于 某些植物、烟草和汽车尾气中。职业暴露是最有可能引起毒性的情况。作业环境 中的苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道，或通过皮肤接触进入人体。短时间接触 高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状长时间接触苯乙烯可引起肺 组织结构损害，从而使工人易患肺炎、肺气肿等疾病。苯乙烯是可疑致癌物，但 在人体内的致癌性还存在争议 苯乙烯在小鼠，大鼠和人体内外均可发生代谢反应，且存在很大的物种间差 异其中小鼠对苯乙烯的代谢速率最快，其次为大鼠和人。苯乙烯经体内p 4 5 0 酶代谢后主要生成苯乙烯环氧化物( s t y r e n eo x i d e ，s o ) ，苯乙烯环氧化物有较 强的氧化性，可引起脂质过氧化，导致细胞氧化损伤。苯乙烯环氧化物同时也是 亲电化合物，可与蛋白质、核酸等亲核生物大分子形成共价结合物，引起蛋白质 功能的改变和基因突变，从而引起细胞损伤苯乙烯还可发生苯环羟基化代谢， 生成羟基苯乙烯，为苯环乙烯的次要代谢途径。 本文从以下三部分研究内容进行深入探讨，为进一步研究苯乙烯的致毒机理 打下基础 t i 1 l c e s i m s 方法检测苯乙烯及l 3 丁二烯代谢物 苯乙烯和1 ，3 丁二烯是塑料和橡胶工业广泛使用的原料。它们主要通过p 4 5 0 酶代谢成为相应的环氧化物，即苯乙烯环氧化物和3 丁烯1 ，2 环氧化物环氧 化物通过环氧化物水解酶或自发水解成为相应的二醇，即苯乙二醇和3 丁烯1 ， 2 二醇。二醇代谢物可以作为苯乙烯和1 ，3 丁二烯暴露的生物标志物。然而苯乙 二醇和3 丁烯1 ，2 二醇很难在质谱的e s i 离子源内有效离子化，所以无法用 e s i m s 检测。而且苯l - - 醇和3 丁烯1 ，2 二醇紫外吸收强度低，最大吸收波长 在低波长处，紫外检测易受到干扰我们开发了柱前衍生化方法用l c e s i m s 方 法测定苯乙二醇和3 丁烯1 ，2 二醇。利用二醇能和硼酸生成硼酸酯的原理，用 2 溴吡啶5 硼酸作为衍生化试剂，使二醇容易离子化，实现苯乙二醇和3 丁烯 1 ，2 二醇的e s i m s 检测。2 溴吡啶5 硼酸分子内含有氮元素，可是促进正离子 模式下的离子化；2 溴吡啶5 硼酸含有溴元素，溴元素有天然的两个同位素，因 此衍生化产物也有两个同位素，在质谱上表现出两个相互重叠的同位素离子峰， 有利于辨别干扰。该衍生化方法操作步骤简便、快速，不但提高了灵敏度，而且 可以鉴别二醇化合物。为了进一步评价2 溴吡啶5 硼酸衍生化其他- - 醇的能力， 我们选取了四个含有不同羟基构象的二醇化合物，测定了它们和2 溴吡啶5 硼酸 的亲和力，发现二醇的构型很大程度上影响到硼酸酯的生成。在环己烷二醇中， 顺式二醇比反式构型的有更强的亲和力，而且环的刚性会影响亲和力 2 苯乙烯环氧化物蛋白结合物立体选择性抗体的制备 苯乙烯对人和动物有肺毒性和肝脏毒性。苯乙烯环氧化物是主要的致毒代谢 中间产物，它能和蛋白质如白蛋白和血红蛋白发生共价结合苯乙烯环氧化物有 两个光学异构体，而且有报道r 型的苯乙烯环氧化物比s 型的毒性大我们制备 了能够立体选择性的识别苯乙烯环氧化物半胱氨酸残基共价结合物的多克隆抗 体通过将苯乙烯环氧化物对映体分别和巯基化的钥孔帽贝血蓝蛋白( k e y h o l e l i m p e th c m o c y a n i n ，k l h ) 结合制备免疫用抗原通过用免疫抗原免疫家兔制备 得到多克隆抗体。e l i s a 结果显示6 只家兔都产生了针对苯乙烯环氧化物牛血清 白蛋白的抗体，和牛血清白蛋白b s a 没有交叉反应3 只用r 抗原免疫的家兔产 1 1 1 生的抗血清都有较好立体选择性，而只有1 只用孓抗原免疫的家兔有立体选择 性。我们进一步用竞争性e l i s a 和免疫印迹实验验证了抗体的立体选择性，抗体 可以识别w i 3 8 细胞经苯乙烯环氧化物暴露后的蛋白结合物。而且应用竞争性 e l i s a 和竞争性免疫印迹方法研究发现，手性中心的羟基是免疫识别所必须的 用w e s t e r nb l o t 分析了细胞暴露于苯乙烯后的细胞总蛋白，发现苯乙烯环氧化物 与蛋白的共价结合缺乏选择性 3 4 羟基苯乙烯在苯乙烯致毒过程中的作用 苯乙烯的苯环羟基化是苯乙烯代谢的另一条途径，为苯乙烯的次要代谢途 径。在苯乙烯暴露的工人尿液中可以检测到4 羟基苯乙烯( 4 - v p ) 在小鼠和大 鼠的苯乙烯体内代谢研究中都发现了4 v p 。4 v p 占苯乙烯代谢的比例较小，根 据报道，在小鼠中4 - v p 代谢物占苯乙烯总尿液代谢物的6 ，大鼠中占l ，人 中小于o 1 。但4 v p 的体内毒性比s o 大。4 - v p 苯乙烯致毒过程中的地位如 何，目前还没有定论。我们通过比较苯乙烯和4 氟取代苯乙烯的体内外毒性和它 们的代谢来研究4 - v p 在苯乙烯致毒的过程中的作用。结果显示，1 ) ：苯乙烯和 4 氟苯乙烯的体内外毒性在均同一水平；2 ) 在小鼠肝微粒体中，苯乙烯苯环羟基 化产物有2 ，3 和4 羟基苯乙烯，而4 氟苯乙烯没有检测到苯环羟基化产物，双 键环氧化是苯乙烯和4 氟苯乙烯的主要代谢途径；3 ) ：小鼠肝微粒体代谢1 0 m i n 后，4 v p 的生成速率约为s g 的0 0 7 。因此，我们认为苯乙烯和4 氟苯乙烯 的毒性水平相同，而4 氟苯乙烯不能代谢为4 v p ；在小鼠肝微粒体，苯乙烯代谢 为4 - v p 的速率低，4 v p 在苯乙烯致毒过程中的作用是有限的。初步研究表明，2 ，3 和4 羟基苯乙烯在小鼠肝微粒体中快速代谢为二羟基苯乙烯和羟基苯乙烯二 醇，且不同底物有不同的产物选择性。 关键词：苯乙烯；苯乙烯环氧化物；苯乙二醇；羟基苯乙烯；毒性；1 , 3 丁二 烯；3 丁烯i ，2 二醇；电喷雾质谱；苯乙烯环氧化物蛋白结合物；多克隆抗 体；立体选择性；微粒体 i v d e t e c t i o no fs o m es t y r e n em e t a b o l i t e sa n d i n v e s t i g a t i o no f t h e i rt o x i c i t y m a j o r ：p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s a u t h o r ：s h e ns h u i j i e s u p e r v i s o r ：z e n gs u a b s t r a c t s t y r e n e ( c a s ：10 0 4 2 - 5 ) i sa r li m p o r t a n tm a t e r i a lo fp l a s t i ca n dr u b b e ri n d u s t r y s t y r e n ec a np o l y m e r i z et op o l y s t y r e n eo rf o r mc o p o l y m e r sw i t ho t h e rm o n o m e r s i tw a s u s e dt om a n u f a c t u r ep l a s t i cr e s i na n dc o m p o s i t er u b b e r p l a s t i ca n dr u b b e rp r o d u c t s c o n t a i n i n gs t y r e n e a r ew i d e l yu s e di nd a i l yl i f ea n di n d u s t r y , s u c ha sp a c k a g i n g m a t e r i a l s ，i n s u l a t i o n ，d i s p o s a b l ef o o dc o n t a i n e r s ，a n dc u p se ta 1 t h ea n n u a lp r o d u c t i o n o fs t y r e n ei sl l u g e t h eg l o b a la n n u lp r o d u c t i o no fs t y r e n ei s3 0m i l l i o nt o n s ，o fw h i c h m o r et h a n1m i l l i o nt o n si sp r o d u c e di nc h i n a s t y r e n ei sa l s op r o d u c e db yc e r t a i n p l a n t s ，s m o l ( i n ga n dc a re x h a u s t t h em a i ns i t u a t i o no f t o x i ce x p o s u r ei st h ew o r k e r s e x p o s e dt os t y r e n ei nt h ep l a s t i cp r o d u c t i o ne n v i r o n m e n t t h ew o r k e r sw e r em a i n l y e x p o s e dt h r o u g hr e s p i r a t o r yt r a c ta n ds k i nc o n t a c t s h o r tt i m ee x p o s u r et os t y r e n ec a n c a u s ei r r i t a t i o nt os k i na n dr e s p i r a t o r yt r a c t l o n gt i m ee x p o s u r ec a u s el u n gi n j u r ya n d t e n dt oh a v el u n gi n f e c t i o n s t y r e n ei sap o t e n t i a lc a r c i n o g e n ，b u ti t sc a r c i n o g e n i c i t yt o h u m a ni ss t i l ln o tc o n f i r m e d s t y r e n em e t a b o l i s mr e s e a r c hw a sp r i m a r i l yp e r f o r m e di nm i c e ，r a t s ，a n dh u m a n , e x h i b i t i n gas i g n i f i c a n ts p e c i e sd i f f e r e n c e s t y r e n ew a sm e t a b o l i z e dm o r ef a s f l yi n m o u s et h a ni nr a ta n dh u m a n s t y r e n ei sm a i n l ym e t a b o l i z e dt os t y r e n eo x i d eb y c y t o c h r o m ep 4 5 0 s s t y r e n eo x i d ei sa 1 1o x i d i z i n ga g e n ta n dc a nc a u s ec e l lo x i d i z i n g i n j u r y a n ds t y r e n eo x i d ei s a l s oa ne l e c t r o p h i l i cc o m p o u n da n dc a l lr e a c tw i t h n u c l e o p h i l i cb i o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n sa n dn u c l e o t i d e s ，f o r m i n gc o v m e n tb i n d i n g a n dc h a n g i n gp r o t e i nf u n c t i o n , i n d u c i n gm u t a t i o n t h eo x i d a t i o no fp h e n y lr i n gi s a n o t h e rm i n o rm e t a b o l i s mp a t h w a yo fs t y r e n e v t h i ss t u d yi sa i m e dt oo b t a i nf u r t h e rk n o w l e d g eo ft h em e c h a n i s mo fs t y r e n e t o x i c i t y w ei n v e s t i g a t e ds t y r e n et o x i c i t yf r o mt h ef o l l o w i n gt h r e ep a r t s 1 d e t e c t i o no fd i o lm e t a b o l i t e so fs t y r e n ea n d1 , 3 - b u t a d i e n eb yl c e s i - m s m e t h o d s t y r e n ea n d1 , 3 - b u t a d i e n ea r ei m p o r t a n ti n t e r m e d i a t e se x t e n s i v e l yu s e di nt h e p l a s t i c si n d u s t r y t h e ya r em a i n l ym e t a b o l i z e dt h r o u g hc y t o c h r o m e sp 4 5 0 - m e d i a t e d o x i d a t i o nt ot h ec o r r e s p o n d i n ge p o x i d e s ，w h i c ha r es u b s e q u e n t l yc o n v e r t e dt od i o l sb y e p o x i d eh y d r o l a s eo rt h r o u g hs p o n t a n e o u sh y d r a t i o n t h er e s u l t i n gs t y r e n eg l y c o la n d 3 - b u t e n e 一1 ，2 - d i o lh a v eb e e ns u g g e s t e da sb i o m a r k e r so fe x p o s u r et os t y r e n ea n d1 , 3 b u t a d i e n e ，r e s p e c t i v e l y u n f o r t u n a t e l y ，p o o ri o n i z a t i o no ft h ed i o l sw i t h i ne l e c t r o s p r a y m a s ss p e c t r o m e t e r sb e c o m e st h eo b s t a c l et ot h ed e t e c t i o no ft h et w od i o l sb yl c e s i m s w ed e v e l o p e da nl c e s i m sa p p r o a c ht oa n a l y z es t y r e n eg l y c o la n d3 - b u t e n c - 1 ，2 一d i o lb ym e a n so fd e r i v a t i z a t i o nw i t h2 - b r o m o p y r i d i n e 5 - b o r o n i ca c i d ( b p b a ) ， w h i c hn o to n l yd r a m a t i c a l l yi n c r e a s e st h es e n s i t i v i t yo fd i o ld e t e c t i o nb u ta l s of a c i l i t a t e s t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h ed i o l s t h ea n a l y t i c a la p p r o a c hd e v e l o p e dw a ss i m p l e ，q u i 出a n d c o n v i n c i n gw i t h o mn e e do fc o m p l i c a t e dc h e m i c a ld e r i v a t i z a t i o n i no r d e rt oe v a l u a t e t h ef e a s i b i l i t yo fb p b aa sad e r i v a t i z i n gr e a g e n to fd i o l s ，w ei n v e s t i g a t e dt h ei m p a c to f d i o lc o n f i g u r a t i o no nt h ea f f i n i t yo fas e l e c t i o no fd i o l st ob p b au s i n gt h ee s t a b l i s h e d l c e s i m sa p p r o a c h w ef o u n dt h a tc s - d i o l ss h o w e dh i g h e ra f f i n i t yt ob p b at h a n t r a n s - d i o l sa n dt h a tt h er e a c t i v i t yo fv i c i n a ld i o l st ob p b ad e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e i nt h e i rm o l e c u l a rr i g i d i t y i nc o n c l u s i o n ，b p b am a yb eu s e da sag e n e r a ld e r i v a t i z i n g r e a g e n tf o r t h ed e t e c t i o no fv i c i n a ld i o l sb yl c m s 2 d e v e l o p m e n to fe n a n t i o s e l e e t i v ep o l y c l o n a l a n t i b o d i e st od e t e c ts t y r e n e o x i d ep r o t e i na d d u c t s s t y r e n eh a sb e e nr e p o r t e dt ob ep n e u m o t o x i ca n dh e p a t o t o x i ci nh u m a n sa n d a n i m a l s s t y r e n eo x i d e ，am a j o rr e a c t i v em e t a b o l i t eo fs t y r e n e ，h a sb e e nf o u n dt of o r m c o v a l e n tb i n d i n gw i mp r o t e i n s ，s u c ha sa l b u m i na n dh e m o g l o b i n s t y r e n eo x i d eh a s t w oo p t i c a li s o m e r sa n di tw a sr e p o r t e dt h a tt h e 僻) 一e n a n t i o m e rw a sm o r et o x i ct h a nt h e ( 研- e n a n t i o m c r t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a s t od e v e l o pp o l y c l o n a la n t i b o d i e st h a tc a n s t e r e o s e l e c t i v e l yr e c o g n i z ep r o t e i n sm o d i f i e db ys t y r e n eo x i d ee n a n t i o m e r sa tc y s t e i n e r e s i d u e s i m m u n o g e n sw e r ep r e p a r e db ya l k y l a t i o n o ft h i o l a t e dk e y h o l el i m p e t h c r n o c y a n i n ( k l h ) 谢t hs t y r e n eo x i d ee n a n t i o m e r s p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r er a i s e d b yi m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t l lt h ec h i r a li m m u n o g e n s t i t r a t i o nt e s t ss h o w e da l ls i x r a b b i t sg e n e r a t e dh i g l lt i t e r so fa n t i s e r at h a tr e c o g n i z e 俾) - 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r e c o g n i t i o nd e p e n d e do nt h e a m o u n to f p r o t e i na d d u c t sb l o t t e da n dh a p t e nl o a d i n gi np r o t e i na d d u c t s 3 t h er o l e so fv i n y l p h e n o l si ns t y r e n et o x i c i t y o x i d a t i o no nt h ep h e n y lr i n gi sa n o t h e rr e p o r t e dm e t a b o l i s mp a t h w a yo fs t y r e n e 4 v i n y l p h e n o l ( 4 v p ) ，w h i c hi s ar i n go x i d a t i o np r o d u c t ，w a sf o u n da sam i n o r m e t a b o l i t ei nt h eu r i n eo ft h ew o r k e r se x p o s e dt os t y r e n e i tw a sa l s oo b s e r v e di nm i c e a n dr a t sa f t e re x p o s u r et os t y r e n e i tw a sr e p o r t e dt h a ta p p r o x i m a t e l y6 o fu r i n a r y s t y r e n em e t a b o l i t e sw e r er i n go x i d i z e dp r o d u c t d si n m o u s e w h e r e a si nr a tt h a t a c c o u n t e df o ro n l ya b o u t1 u r i n a r ym e t a b o l i t e sa n di nh u m a nw a sl e s st h a n0 1 4 - v pi sam i n o rm e t a b o l i t eo fs t y r e n e ，w h i l ei t st o x i c i t yi nv i v oi sm u c hh i g h e rt h a n s t y r e n eo x i d e t h ei m p o r t a n c eo f4 - v pi ns t y r e n e i n d u c e dt o x i c i t yi su n k n o w n w e a p p l i e d4 - f l u o r o s t y r e n et op r o b et h er o l eo f 4 一v pi ns t y r e n e i n d u c e dt o x i c i t ya n df o u n d t h a t4 一f l u o r o s t y r e n es h o w e ds i m i l a rt o x i c i t yp o t e n t i a la ss t y r e n eb o n li nc u l t u r e dc e l l s a n dm i c e i nm o u s el i v e rm i c r o s o m a li n c u b a t i o n s ，4 - f l u o r o s t y e n ef a i l e dt ob e m e t a b o l i z e dt o4 - v p ，w h i l e4 - f l u o r o s t y r e n eo x i d ew a so b s e r v e da st h em a j o rm e t a b o l i t e v o f4 一f l u o r o s t y r e n e a f t e r10m i ni n c u b a t i o ni nm o u s el i v e rm i c r o s o m e ，4 一v p s g f o r m a t i o nr a t ei so n l yo 0 7 t h eo b s e r v e dt o x i c i t yo f4 - f l u o r o s t y r e n ea l o n gw i t l lt h e l a c k i n go ft h ef o r m a t i o no f4 v pf r o m4 f l u o r o s t y r e n ei m p l i e st h a t4 一v ph a sl i t t l e c o n t r i b u t i o nt ot h ec y t o t o x i c i t yo fs t y r e n e ac o m p r e h e n s i v es t u d yw a sc o n d u c t e dt oe x p l o r eo x i d a t i v em e t a b o l i t e so f s t y r e n eu s i n gm o u s el i v e rm i c r o s o m e s b e s i d e ss t y r e n e7 , 8 - o x i d ea n d4 - v p ，w e i d e n t i f i e d2 - v pa n d3 一v pw h i c hh a v en e v e rb e e nr e p o r t e d i na d d i t i o n ，2 v p ，3 一、伊， a n d4 - v pw e r ef o u n dt ob em e t a b o l i z e dt ot h e c o r r e s p o n d i n g c a t e c h o la n d d i h y d r o x y s t y r e n ea sw e l la st h e i r7 , 8 一o x i d e s k e y w o r d s ：s t y r e n e ；s t y r e n eo x i d e ；s t y r e n eg l y c o l ；v i n y l p h e n o l ；t o x i c i t y ；1 , 3 一b u t a d i e n e ； 3 - b u t e n e 一1 ，2 一d i o l ；b o r o n i ca c i d ；e s i - m s ；s t y r e n eo x i d ep r o t e i na d d u c t ；p o l y c l o n a l a n t i b o d y ；s t e r e o s e l e c t i v e ；m i c r o s o m e v i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：矽b 啦童签字日期：彬7 7 年6 月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堑塑太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堑堑太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：张他 签字日期：钆刀7 年l ；月哆日 导师签名： 黼期：夸加弓日 致谢 在论文完成之际，首先感谢我的恩师曾苏教授和郑江教授，是你们给了我难 得的机会和谆谆不倦的教导，学生将永远牢记在心，在此向你们致于崇高的敬 意 从湖滨到紫金港，从杭州到西雅图，七年时间过得很快也很慢。人生最好的 时光就溶解在这充满矛盾和希望的七年里，有多少希冀，多少彷徨，才到迎来最 后胜利的曙光。 七年里，我还得到了浙江大学药学院许许多多老师和同学的关心和帮助。感 谢蒋惠娣教授、姚彤炜教授、陈枢青教授、楼宜嘉教授、余露山副教授、陈静老 师对我的指导和关心感谢药学院张小玲老师、黄佩芳老师、马晓薇老师、朱卡 琳老师、王立明老师、刘伟老师、姚晨老师等对我的关心和帮助。 感谢实验室曾经和现在的师兄弟姐妹们，唐意红、王向军、王晓丹、王以、 王金朝、金银秀、徐亚萍、俞春娜、鲁鑫焱、洪燕君、李福高等，是他们和我一 起度过了漫长的研究生生涯还要感谢西雅图儿童医院研究所一起工作的同事和 同学，特别感谢张凡博士在化学合成过程中给予的帮助感谢加州大学戴维斯分 校s h i r l e y g e e 和b r u c e d h a m m o c k 教授在多克隆抗体制备方面给予的支持 最后感谢我的家人和朋友，他们的支持永远是我前进的动力 沈水杰 2 0 0 9 年5 月 第一章l c e s i m s 方法检测苯乙烯及1 , 3 t 烯代谢物 1 1 前言 环氧化物通常是含有碳碳双键( c = c ) 的化合物经c y p 4 5 0 酶代谢后的主要 代谢物。环氧化物不稳定，随后自发水解或经环氧化物水解酶( e p o x i d e h y d r o l a s e ) 催化水解为二醇产物环氧化物是亲电性化合物，可以和蛋白质或核 酸的亲核基团产生共价结合，如巯基、氨基等。小分子化合物和蛋白或核酸的共 价结合可能是化合物致毒的原因之一，蛋白的共价结合可能导致蛋白功能的丧失 1 - 3 苯乙烯( s t y r e n e ，1 ) 和l ，3 丁二烯( 1 ，3 b u t a d i e n e ，4 ) 是塑料橡胶工业重要的 中间体，用于生产制造加强塑料、丁烯橡胶、氯丁烯橡胶、a b s 树脂、聚苯乙烯 塑料等聚合物或共聚物，在工农业生产和日常生活中得到广泛应用【4 ，5 1 。在塑胶 行业工厂工作的工人最有可能接触高浓度的此类化合物，即职业暴露。在一般自 然环境中，如水、土壤、空气中也可以检测到低浓度的苯乙烯和1 ，3 丁二烯。如 图1 1 ，苯乙烯和1 , 3 丁二烯在人体内经c y p 4 5 0 酶代谢为环氧化物，即苯乙烯环 氧化物( s t y r e - 7 ，8 - o x i d e , 2 ) 和3 丁烯一1 ，2 - 环氧化物( 3 - b u t e n e 一1 ，2 - e p o x i d e ， 5 ) ，参与代谢的酶主要为c y p 2 e 1 和c y p 2 f 1 。环氧化物水解为相应的二醇，即 苯l - - 醇( s t y r e n eg l y c o l ，3 ) 和3 一丁烯- 1 ，2 一二醇( 3 - b u t e n e 一1 ，2 - d i o l ，6 ) 。作为主 要的代谢物，苯乙二醇和3 丁烯1 ，2 二醇与暴露水平呈现一定相关性，所以苯乙 二醇和3 丁烯1 ，2 二醇有可能作为生物标志物( b i o m a r k e r ) 来评价苯乙烯和l ，3 丁二烯的暴露程度0 , 6 1 。 飞上! 虬渊旦一人o h 45 6 e h ：e p o x i d eh y d r o l a s e f i g u r e1 1 m e t a b o l i s mo fs t y r e n ea n d1 , 3 - b u t e d i e n et od i o l s 目前，苯l - - 醇的分析方法有高效液相色谱法( h p l c u v ) 【7 ，引，气相色谱 法，检测器有氢火焰离子化检测器( f i d ) ，热导检测器( t c d ) 或质谱检测器 ( m s ) 9 - 1 5 。 3 丁烯1 ，2 二醇的分析一般使用气相色谱法，检测器有f i d ，t c d 或m s 由于苯乙二醇的紫外吸光系数较小，最大吸收波长在近2 0 0n l n 处，所以 用h p l c 分析时，其灵敏度较低，干扰较大，不适合复杂生物样品的测定而3 丁烯1 ，2 二醇由于缺少生色团而无法用h p l c 检测。目前l c e s i m s 已经逐渐成 为常规的分析方法但是由于苯乙二醇和3 丁烯1 ，2 二醇不能在e s i 离子源有效 离子化，所以他们不能使用常规的l c e s i m s 直接分析 开发一种可靠的、灵敏的分析方法是检测生物标志物的基本要求。本实验建 立了一种硼酸柱前衍生化l c e s i m s 方法用于分析苯l - 醇和3 丁烯1 ，2 二醇。 硼酸可以和邻二醇或1 ，3 二醇反应生成硼酸酯，利用2 溴吡啶5 硼酸分子中的氮 原子易于离子化的特点来检测二醇类化合物，提高分析灵敏度( 图1 2 ) 0 h0 h0 h + h = = b r 0 hrr f i g u r e1 2 r e a c t i o no f2 - b r o m o p y r i d i n e - 5 - b o r o n i ca c i dw i t l ld i o l s 2 4 - 2 1 0 r 毫 r q 1 2 材料与方法 1 2 1 仪器与试药 l c e s i m s 系统包括a g i l e n t1 1 0 0 高效液相色谱系统( a g i l e n t ，u s a ) 和 s c i e xa p i2 0 0 0 多重四级杆质谱仪( a p p l i e db i o s y s t c m s ，f o s t e rc i t y , c a ) ，电喷 雾离子源( t u r b o i o n s p r a ys o u r c e ) 保护柱( c 1 8 ，2l x m ) 和分析柱( c 1 8 ，2 1 1 0 0n l m ，3p m ) 均购自a l l t e c h 公司( d e e r f i e l d ，i l ，u s a ) a n a l y s ts o f t w a r e 1 4 1 ( a p p l i e db i o s y s t e m s ，f o s t e rc i t y , c a ) 软件用于控制l c e s i m s 系统和质 谱数据处理。岛津1 0 a v p 高效液相色谱仪配备二极管整列检测器p d a 用于苯乙 二醇的h p l c 分析3 0 0m h z 核磁共振仪( v a r i a n ta s s o c i a t e s ，p a l oa l t o ，c a ) 用 于实验室合成化合物的结构确定。 2 溴吡啶- 5 - 硼酸( 2 - b r o m o p y r i d i n e 一5 - b o r o n i ca c i d ，b p b a ，1 1 ) 、苯乙二醇 ( s t y r e n eg l y c o l ，1 - p h e n y l - 1 ，2 e t h a n e d i o l ，3 ) 、3 - 丁烯- 1 ，2 - 二醇( 3 - b u t e n e - l ，2 - d i o l ，6 ) 、顺式1 ，2 环己二醇( c 西1 ，2 c y c l o h e x a n e d i o l ，9 ) 、反式1