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大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用 摘要 本研究利用微卫星标记，以亲缘关系较远的大菱鲆父母本杂交构建的一个 f l 家系为作图群体，构建了大菱鲆遗传连锁图谱并对相关生长性状如：体长，体 重，体厚进行了q t l 分析。本研究的具体内容如下： 1 、采用富集文库菌落原位杂交的方法构建大菱鲆微卫星富集文库，共筛选 得到9 5 2 个克隆，通过序列比对和重复序列筛查，得到含有重复序列的独立克隆 7 5 3 个，占全部克隆数的7 9 1 0 。通过t a l l d e mr e p e a t sf i n d e r ( t i 心) 软件的进一步 筛查，得到1 0 0 4 个含串联重复序列的位点，其中微卫星位点8 3 1 个( 8 2 7 7 ) ， 小卫星序列位点1 7 3 个( 1 7 2 3 ) 。利用实验室设计的软件对序列进行分析，得 到结论如下：1 ) 微卫星重复序列中，重复序列数目所占比例与累计长度的所占 比例情况基本一致，两碱基重复类型累计长度所占的比例最大，其次是四碱基、 三碱基、六碱基和五碱基类型，而单碱基重复类型在本研究中鲜有发现；2 ) 重 复单位拷贝数变异能力分析表明，变异系数最大的是三碱基；3 ) 重复序列重复 单位长度与其拷贝数的相关分析表明，二者呈负相关( ，= 0 5 ，p0 0 7 2 ) ，即随 着重复单位的增加，其拷贝数在减少。以上结果为物种之间微卫星分布频率和丰 度的比较、微卫星标记的开发及微卫星进化和功能的研究等工作提供基础。 2 、本研究利用了富集文库菌落原位杂交的方法开发的6 5 3 个微卫星标记， 利用含有f l 代亲本在内的多个个体对位点进行多态性评价，共得到2 8 4 个多态 性的位点，其中1 5 8 个标记在所构建图谱家系亲本间具有多态性，分别有1 2 5 个和1 18 个标记可用于母本和父本遗传连锁图谱的构建。卡方检验显示，母本分 离标记中有偏分离标记( p 0 0 1 ) 1 0 个( 8 0 ) ，其它l1 5 个标记符合孟德尔1 ：1 分离规律可用于连锁分析；父本分离标记中有偏分离标记( p o 0 1 ) 1 3 个( 1 1 o ) ， 其它1 0 5 个标记符合孟德尔l ：1 分离规律可用于连锁分析。利用父母本的分离 标记，分别对大菱鲆母本和父本作图。所构建的母本连锁图谱共3 0 个连锁群， 1 1 0 个标记连锁群总长度为9 1 9 1c m ，平均标记间隔为1 2 9c m 。所构建的父本 连锁图谱共2 1 个连锁群，1 1 0 个标记连锁群总长度为7 2 1 7c m ，平均标记间隔 为9 9c m 。根据计算，母本连锁图谱的预期长度为1 6 9 5 0c m ，覆盖率为3 5 5 ； 父本连锁图谱的预期长度为1 1 3 7 3c m ，覆盖率为4 8 2 。连锁分析结果显示， 大菱鲆母本遗传连锁图谱比父本遗传连锁图谱长4 9 o ，这可能说明大菱鲆不同 性别存在不同的重组率。 利用所构建的图谱对大菱鲆体长，体重和体厚进行q t l 定位。在父本连锁图 谱上仅检测得到一个可能与体长相关的q t l 。q t l 定位，为我们从事今后的分子 标记辅助育种工作提供了参考。 关键词：大菱鲆( s c o p h t h a i m u sm a x i m u sl ) ，微卫星，富集文库，连锁图谱， o l t 定位 d e v eio p m e n t ，c h ar a c t e riz a tio na n da p pi ic a tio no f m ic r o s a t el iit em a r k e r sint u r b o t ( s c o p h t h ai m u sm a x i m u sl ) a b s t r a c t g e n e t i cl i n k a g em a p sw e r ec o n s t r u c t e df o rt u r b o t ( s c o p h t h a l m u sm a x i m u sl ) u s i n gm i c r o s a t e l l i t em a r k e r si na nf 1f a m i l ya n dq u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ( q t l ) a s s o c i a t e d 、加t l lt h eg r o w t ho ft u r b o tw e r ed e t e c t e da n dl o c a t e di nt h em a p s 1 i np r e s e n ts t u d y , b yc o n s t r u c t i o nt h em i c r o s a t e l l i t ee n r i c h m e n tl i b r a r i e sa n d c o l o n yh y b r i d i z a t i o n ，m i c r o s a t e l l i t e s w e r ei s o l a t e df o r t h et u r b o t ( s c o p h t h a l m u s m a x i m u sl ) c o v e r i n gt h ew h o l eg e n o m ei nal a r g es c a l e b y14d i f f e r e n tp r o b e s d e t e c t i o n ，9 5 2c l o n e sw e r es e q u e n c e da n da f t e rc l u s t e ra n a l y s i s ，7 5 3 i n d i v i d u a l p o s i t i v ec l o n e sw e r ef i n a l l yo b t a i n e d u s i n gv e c t o rn t is u i t e8 0 ( i n v i t r o g e n ) a n d t a n d e mr e p e a t sf i n d e r ( t r f ) s o f t w a r e ，at o t a lo f10 0 4t a n d e mr e p e a ts e q u e n c e sw e r e f o u n d ，i n c l u d i n g8 31 m i c r o s a t e l l i t e sa n d17 3m i n i s a t e l l i t e s ，w h i c ha c c o u n t e df o r 8 2 7 7 a n d17 2 3 o ft o t a lr e p e a ts e q u e n c e sr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fa n a l y z i n g t h ed i f f e r e n tn u c l e o t i d eu n i tc r o s s i n gt h ew h o l eg e n o m eo ft u r b o tw e r ea l s o r e p r e s e n t e d i ts h o w e dt h a t ：t h ed i - n u c l e o t i d eu n i tw a st h ed o m i n a n tr e p e a t u n i t a m o n g t h es i xr e p e a tu n i tt y p e s ，w h o s en u m b e rw a st h em o s ta b u n d a n t ，a n dt h er e p e a t u n i tc u m u l a t i v el e n g t hw a st h el a r g e s ta sw e l l ，w h i l et h ep e n t a - n u c l e o t i d et y p ew a s d i s a d v a n t a g ei nt h ew h o l er e p e a tu n i tt y p e s t h ec v ( c o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n ) w a s i n t r o d u c e dt oe v a l u a t et h ea b i l i t yo ft h er e p e a t e dv a r i a t i o no fm i c r o s a t e l l i t e s t h e a g g ( 1 2 6 11 ) m o t i fw a st h em o s tv a r i a b l er e p e a tu n i tt y p ei nt h i sr e s e a r c hw i t hac v v a l u e12 6 11 ，b u tt h ea v e r a g ec vo fd i - n u c l e o t i d e sw a st h em o s tc o m m o nt y 7 p ea m o n g t h es i xr e p e a tu n i tt y p e sa st h eb a s i so fo r i g i na n de v o l u t i o no fr e p e a ts e q u e n c e s i n t h i ss t u d y , an e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h el e n g t ho fr e p e a tu n i t sa n dt h ea v e r a g e c o p yn u m b e rw a sd e t e c t e d ( 厂2 0 5 ，尸_ 0 0 7 2 ) 2 s i xh u n d r e da n df i f t y - t h r e ep r i m e rp a i r sw e r ed e s i g n e da n d2 8 4p r i m e rp a i r s w i t hh i g h p o l y m o r p h i s m s w e r e s c r e e n e d ，w h i c h w e r e d e v e l o p e df r o mt h e s s r - e n r i c h e dl i b r a r i e s t h eg e n e t i cl i n k a g em a po ft u r b o tw a s p e r f o r m e du s i n ga l lf l f a m i l y ，a n dt h em a pw a sc o n s t r u c t e du s i n g15 8m i c r o s a t e l l i t em a r k e r sa m o n ga l lt h e p o l y m o r p h i cm a r k e r s o ft h e s es e g r e g a t i n gm a r k e r s ，12 5w e r em a p p e dt ot h ef e m a l e f r a m e w o r km a pa n d10 ( 8 0 ) m a r k e r ss h o w e das i g n i f i c a n td i s t o r t i o nf r o mt h e e x p e c t e d1 ：lr a t i o ( p 0 01 ) f i n a lf e m a l el i n k a g em a pc o n s i s t e do f3 0l i n k a g eg r o u p s s p a n n i n g9 19 1c mw i t ha 1 1a v e r a g ed i s t a n c eo f1 2 9c m a n d118w e r ea s s i g n e dt o2 2 l i n k a g eg r o u p si nm a l em a p ，a n d13 ( 11 o ) m a r k e r ss h o w e das i g n i f i c a n td i s t o r t i o n f r o mt h ee x p e c t e d1 ：1r a t i o ( p b c d h 。 1 1 3 2 作图标记的选择 构建遗传连锁图谱的另一个重要步骤为选择合适的遗传标记。遗传标记是指 5 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用 博士论文 用来区分不同个体或群体并能够稳定遗传的物质或特性，它是可以明确反映遗传 多态性的生物特征。遗传标记在遗传学的建立和发展过程中起着重要的作用，也 是遗传育种的重要工具。任何遗传分析都是以遗传标记为基础的，它能反映不同 群体或不同个体的差异，在群体遗传学研究、基因定位、动植物育种上均有重要 意义。理想的遗传标记主要应具备以下几条标准：1 ) 具有较强的多态性；2 ) 表 现为共显性，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型：3 ) 选择中性( 即无基因多效 性) ；4 ) 对主要的性状无影响；5 ) 经济方便和易于观察记载：6 ) 遍布整个基 因组；7 ) 开发成本和使用成本尽量低廉；8 ) 在实验室内和实验室间的重复性好 ( 便于数据交换) 。 随着分子生物学水平的发展，遗传标记技术也随之发展，先后经历了形态学 标记，细胞学标记，同工酶标记，这三种标记都是基因表达型标记，易受环境条 件和发育阶段的影响，可利用的多态性位点较少。2 0 世纪8 0 年代以来，自从b o s t e i n 等( 1 9 8 0 ) 首次利用限制性酶切片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 标记，构建人类遗传连锁图谱奠定了分子标记技术研究的 基础以来，随着分子生物学的发展，分子克隆技术和d n a 重组技术的日趋完善， 特别是p c r 技术和新的电泳技术的产生，使各种分子遗传标记应运而生。由于分 子遗传标记突破了表达型的局限性，具有稳定性高、受环境条件的影响较小、信 息含量高等特点，使其成为在种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图 谱绘制、遗传纯度检测、遗传连锁图谱构建及基因标记定位与克隆等方面不可缺 少的工具。可用于构建连锁图谱的分子标记可分为三代，第一代是以r f l p 为代 表的分子标记，第二代分子标记包括r a p d ，a f l p 和微卫星等，并以微卫星为 代表，第三代分子标记的代表是单核苷酸多态( s n p ) 。目前常用的作图d n a 分子标记包括a f l p ，微卫星和s n p 。与传统标记方法相比，分子标记具有分布 广、多态性高、不受环境及季节和发育期影响等优点。由于分子标记直接提示来 自基因组d n a 的变异，使育种家有可能依据植物基因型而不只是表现型来选择 优良性状组合，并通过对分子标记的深入研究最终达到分离、克隆并在d n a 水 平上直接操纵有益基因的目的。 1 1 3 2 1 形态学标记 形态学标记，又称为表型性状，可见标记。本世纪初，孟德尔以豌豆为材料， 6 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用博士论文 详细的研究了7 对相对性状的遗传，这些性状都具有典型的外部形态特征，容易 识别。形态学标记可以直接观测，从表型上观察就可选择到与之连锁的目标个体。 例如番茄的幼苗黄化与抗t m v 紧密连锁，用黄化苗作标记，可在苗期选择到抗 t m v 的植株( 蔡旭，1 9 8 8 ) 。人们已建立了许多作物例如番茄、水稻、棉花的形 态标记遗传图谱( 余诞年，1 9 9 8 ) ，并在育种实践上得以应用。以形态学为基础 的连锁群的建立为生理、生化性状的研究奠定了基础，但形态标记数量少，且易 受环境、生育期等因素影响，使其应用受到了一些限制。 1 1 3 2 2 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征和 数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多 态性。染色体结构特征包括染色体的核型和带型。核型特征是指染色体的长度、 着丝粒位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗 传变异；带型特征是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺 序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。染色体数量特征 是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍 性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、端着丝点染色体等非整倍 体。用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料进行杂交，其后代 常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以 测定基因所在的染色体及其相对位置。因此，染色体结构和数目的特征可以作为 一种遗传标记。细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材 料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择。有些物种对染色体结构和数目 变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料。某些物种虽然已有细胞学标记材 料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难， 从而限制了细胞学标记在图谱构建等方面的应用。 1 1 3 2 3 生化标记 生化标记是指以蛋白质尤其是同功酶为基础的遗传标记。与其他蛋白质一 样，同工酶是基因表达的产物，由于不同的同工酶所带的电荷不同，可通过电泳 分离，并经与底物反应或染色，检测它们的存在与否和分子质量的大小，因而可 作为遗传标记。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记数量更丰富，受环境影 7 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用 博士论文 响小，能更好地反映遗传多态性。并且由于同功酶标记显示同一种酶的不同结构 形式，揭示了功能和编码基因序列的差异，属于共显性标记，易于区别杂合和纯 合位点，因此被广泛应用于品种鉴别和纯度鉴定。但同工酶分析仍存在其内在的 局限性：( 1 ) 同工酶是基因表达产物而不是基因本身，在翻译后可能会被修饰， 且其活性受环境及发生状态的影响；( 2 ) 同工酶只能分析编码可溶性酶的基因； 只能检测出可导致产物分子静电荷改变的氨基酸组成性变异；( 3 ) 可以利用的遗 传位点比较少，而且实验结果有时会随动植物不同发育时期及环境而有所变化。 1 1 3 2 4 分子标记 分子标记是指以d n a 多态性为基础的遗传标记。它是d n a 分子缺失、插入、 易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性 的直接反映。其本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的 d n a 片段。与其他遗传标记相比，分子标记具有标记数量大、遗传稳定、大多 数呈中性突变、共显性或完全显性遗传的特点，因此它是继形态学标记、细胞学 标记和生化标记之后应用最为广泛的生物标记技术。从开发的水平与层次来讲， 目前最常用的分子标记技术可以分为以下几类：第一代为基于s o u t h e r n 杂交的分 子标记技术，r f l p 标记技术可以作为代表；第二代是基于p c r 的分子标记技术， 主要有r a p d 、s s r 和a f l p 等标记技术；第三代是基于测序和单核苷酸多态性的 分子标记技术，如阶婵技术。以下对这些标记技术进行了简单概括，由于微卫星 标记技术是本课题重点研究的方向，将在下一节中专门阐述其研究进展情况。 ( 1 ) r f l p 技术 r f l p 技术是基于s o u t h e m 分子杂交技术的一种分子标记( a v i s e ，19 8 3 ) 。其 基本原理是利用限制性内切酶切割不同个体基因组d n a 后，与同位素或非同位 素标记的特异或多座位探针进行s o u t h e r n 杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶 切片段在长度上的多态性。r f l p 标记特点是：无表型效应；等位基因间共显性、 非等位基因间不存在上位效应，互不干扰；但是多态性较低，信息含量不够丰富。 第一个r f l p 遗传连锁图谱诞生于1 9 8 7 年( d o n i s k e l l e r ，1 9 8 7 ) 其饱和度与经典 的遗传连锁图谱相比大为增加。 但这种技术的缺点在于，需要制备放射性探针，同时需要模板量很大，实验 过程繁琐，费用较高，可检测的多态性水平低。现在随着各种非放射性探针技术 8 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用 博士论文 的发展，如地高辛、生物素等标记技术，这个问题已经不复存在，但是随着各种 其他分子标记的广泛发展，此技术已经很少应用。 ( 2 ) r a p d 技术 r a p d ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，即随机扩增多态性d n a ( w e l s h 等，1 9 9 0 ；w i l l i a m s 等，1 9 9 0 ) 。基因组d n a 的一系列不同的随机引物的结合位 点上或位点之间发生碱基插入、缺失而产生的多态。其优点是无须了解基因组背 景、呈共显性遗传、操作方便。其主要的缺点在于稳定性、可重复性差。 ( 3 ) a f l p 技术 a f l p ，a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，扩增片段长度多态性( v o s 等，1 9 9 5 ) 。是建立在r f l p 基础上的选择性p c r ，其原理是将d n a 进行限制性酶 切，再将特定的接头连接在酶切片段的两端，形成一个带接头的特异性片段，以 此为模板，以接头序列和限制酶的切点序列为基础设计引物，进行p c r 扩增。 a f l p 标记实际上是r f l p 和p c r 的结合，所以兼顾r f l p 的稳定性和p c r 的灵活 性。其特点是：信息量大、多态性丰富、灵敏度高、显性遗传。和其他分子标记 一样，a f l p 也有其不足之处，这是由于它主要是一种显性标记，因而在遗传分 析中提供的信息少于共显性标记。但这在相当程度上可由其数量多、相对易于发 展及随机分布性等特点得到补偿。在遗传连锁图构建中，a f l p 标记也有在不同 作图家系或实验室转移和比较的一些困难，这也可在作图中结合使用微卫星标记 得到一定弥补。a f l p 在水生动物遗传学研究包括连锁图谱构建中的应用已有综 述报道( 张留所，2 0 0 3 ) ，l i u 等( 2 0 0 3 ) 在鲇鱼，l i 等( 2 0 0 3 ) 在日本对虾，w a n g 等( 2 0 0 4 ) 在栉孔扇贝中均利用a f l p 标记技术进行了连锁图谱的构建。 ( 4 ) s s r 技术 微卫星是在2 0 世纪9 0 年代后期才被用于染色体作图。对于构建一个有用的遗 传图谱，应该包含丰富的遗传标记，且均匀分布于整个基因组和具有高度多态性， 在不同的实验室间易于识别。而微卫星恰恰具有这些特点。微卫星引物的高通用 性( s c h l o t t e r o e r 等，1 9 9 1 ) ，使在不同种或科的动植物中进行比较遗传图谱构建 成为可能，微卫星标记的共显性，不仅简化了分析过程，且利于不同作图群体间 的标记转换( t h o m a s 等，1 9 9 3 ) 和从遗传图谱向物理图谱的过渡( o l s o n 等，1 9 8 9 ) 。 缺点在于s s r 座位突变率高，对变异反应非常敏感，易受到趋同变异弓起的平行 9 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用博士论文 演化程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差；需要已知部分基因组 d n a 的序列来设计引物，费时耗力。到目前为止，已建成的鱼类微卫星图谱已 有虹鳟、斑马鱼、尼罗罗非鱼和鲤鱼等。 ( 5 ) s n p 技术 s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) ，单核苷酸多态性，是指生物基因组 d n a 中特定位点的单核苷酸存在转换，颠换，插入，缺失等变化。从检测的精 确度角度讲，这是一种比r a p d 、a f l p 和s s r 等分子标记更精确的检测遗传变异 的分子标记技术，通常称为第三代遗传标记。这种技术具有以下一些优点：s n p 种群中的二态性，稳定性和位点丰富性，以及多种非凝胶基础上的s n p 的检测手 段弥补了信息量的不足。人( w a n ge ta l ，1 9 9 8 ；c a r g i l le ta l ，1 9 9 9 ) 小鼠 ( l i n d b l a d t o ne ta l ，2 0 0 0 ) 和其它一些模式动物如果蝇( h o s k i n se ta l ，2 0 0 1 ) 和拟南芥( c h oe ta l ，1 9 9 9 ) 都有大规模的s n p 标记的筛选。 表1 2 几种常见d n a 分子标记技术比较 ( 6 ) e s t 技术 e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) 即表达序列标签，指从不同组织构建的c d n a 文库中，随机挑选不同的克隆，进行末端部分测序得到的e d n a 序列，是一类 专门针对基因组中基因研究的一类分子标记技术。此项技术除了用来发现新基因 ( 赵志辉等，2 0 0 2 ) 外，在基因作 圈( h a t e ye ta l ，1 9 9 8 ) 和i 基因组序列中编码区的 l o 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用 博士论文 确定等方面也得到了应用。同时，由于e s t s 具有很高的多态性还可用作分子标 记，构建遗传连锁图谱( h a r u s h i m ae ta l ，1 9 9 8 ) 。 表1 2 对常用的分子标记技术进行总结，可见，各种标记在很多时候并不是 孤立的，各种标记可以互相联系，重叠甚至转化。例如：a f l p 标记就是r f l p 和r a p d 相结合的产物。在e s t 序列中可能会含有微卫星序列，而e s t 也是挖 掘s n p 的重要来源。r a p d 和a f l p 的扩增产物可以转化成s t s ，s c a r 和c a p s 标记。另外e s t ，微卫星也是获得s t s 的重要来源。目前，人们开始同时采用 多种分子标记技术构建物种基因组的遗传图谱的研究，避免了单种分子标记技术 的局限性，大大提高了图谱的适用性( 孙邵宁等，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 3 标记连锁分析及图谱构建 用选择好的分子标记对作图群体进行分析，获得不同个体的d n a 多态性信 息，是进行遗传连锁分析的第一步。通常各种d n a 标记基因型的表现形式是电 泳带型或峰型，将带型或峰型数字化是d n a 标记分离数据进行数学处理的关键。 对d n a 标记带型转化的基本原则是，必须区分所有可能的带型和情况，并赋予 相应的数字或符号，在这一过程中要考虑到缺失数据的赋值，否则将会影响到标 记的正确定位。 所有利用遗传标记来构建遗传连锁图的基本原理都是相同的，其基本要素 是连锁关系的建立和重组值的估计。两点或多点测验是遗传连锁图谱构建的基本 程序，连锁的基本检测建立在对分离的成对基因座位的重组进行统计学评价的基 础之上。如果要对大量标记之间的连锁关系进行统计分析，就必须借助于计算机 软件。常用的软件有：m a p m a k e 舳x p3 0 ，j o i n m a p2 0 ，l i n k a g e 等。其中 m a p m a k e 舳x p3 0 是一种既可以构建遗传连锁图谱，又可以进行复合性状定 位的软件，可用于多种类型的群体分析，是目前应用比较广泛的软件之一。 1 1 3 3 1 两点检测 如果两个基因座位于同一染色体上且距离较近，则在分离后代群体中通常 表现为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点检测。在进 行检测之前，必须了解各基因座位的等位基因分离是否符合孟德尔分离比例，这 是准确检测连锁关系的前提。检测d n a 标记是否符合孟德尔分离规律时，一般 大菱鲆( t u r b o t ) 微卫星标记的筛选及应用博士论文 采用z 2 检验( 徐云碧等，1 9 9 4 ) ： z ：总的卡方值 z ：检测第一个基因座位分离比是否异常 磊：检测第二个基因座位分离比是否异常 z ：两个座位之间是否连锁 磊= 彳一z 一磊 在实际的遗传标记连锁分析中，在事先未知各基因座位于哪条染色体的情 况下，可先进行两点测验，根据两点测验的结果，将那些基因座分成不同的连锁 群。对于在两点检测中没能归类到某个连锁群的基因座，可在各连锁群的连锁图 初步建立以后，再尝试进行定位。但实际研究中，总会有部分标记无法定位到染 色体上，其原因可能是在测定标记基因型时存在错误。 1 1 3 3 2 多点检测 如何确定标记座位在染色体上的正确排列顺序及彼此间的遗传图距是一个 看似简单但却复杂的问题。同时两点测验每次只能分析两个座位间的连锁关系， 并且通过两点测验估计得到重组率往往存在误差。因此对每个连锁群上的多个标 记进行连锁分析时，必须同时对多个座位进行联合分析，即通过两点检测法将基 因座位分成不同的连锁群后，再利用各连锁群多个座位间的共分离信息来确定它 们的排列顺序，也就是进行多点检测。 1 1 - 3 3 3 重组值估计 两个连锁座位不同基因型出现的频率是估计重组值的基础。重组值的估计 是根据分离群体中重组型个体占总个体的比例来估计。这种方法无法得到估计值 的标准误差，因而无法对估计值进行显著性检验和置信区间估计。目前采用最大 似然法进行重组率的估计。最大似然法以满足其估计值在观察结果中出现的概率 最大为条件，即先对各种可能的基因排列顺序进行最大似然估计，然后通过似然 比检验确定出可能性最大的顺序，并估计出相