免疫学检验6补体参与的反应.ppt

第六章补体参与的反应,19世纪末，在发现体液免疫后不久，Bordet即证明，新鲜血清中存在不耐热的成分，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用。因其是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故被称为补体。,Bordet,SRBC+抗SRBC抗体不溶血SRBC+抗SRBC抗体新鲜动物血清溶血SRBC+抗SRBC抗体加热处理新鲜动物血清不溶血,3730min,3730min,3730min,补体(Complement,C)：是正常存在于人或哺乳动物血清与组织液中的一组被激活后具有酶活性的蛋白质。性质不稳定，加热5630min，可使其灭活。补体的激活途径：经典途径、替代途径、MBL途径,C1分子结构,图1抗原（antigenAg）与抗体（antibodyAb）结合形成免疫复合物（immunecomplexIC）图2免疫复合物与补体结合，使补体发生作用。,Ag,图1,图2,Ab,补体（complement）,SRBC,图1绵羊红细胞与溶血素（hemolysin）即抗绵羊红细胞结合，形成致敏绵羊红细胞（SRBCs）。图2致敏绵羊红细胞与补体结合，使其激活，补体发生溶细胞作用，引起红细胞肿胀，发生溶血。,图1,图2,补体(complement),SRBCs,第一节补体结合试验补体结合试验(complementfixationtest，CFT):-是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。,一、免疫溶血反应,概念:是红细胞-抗体复合物激活补体,导致红细胞溶解的反应。参与成分:绵羊红细胞-SRBC抗SRBC抗体-溶血素补体用途：测定血清总补体活性及单个补体成分功能活性。溶血素效价滴定。作为指示系统，参与补体结合试验。,溶血素效价的测定,试验原理：经绵羊红细胞（SRBC）免疫的动物（小鼠或家兔）血清中可出现抗SRBC的抗体。采集免疫动物血液分离血清，即可获得抗SRBC的抗血清。当用SRBC与相应抗血清混合，有补体存在时，在一定条件下，SRBC被溶解破坏。因此抗SRBC抗体又称为溶血素。,溶血素效价使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀释度。,免疫溶血反应的试剂,稀释缓冲液常用pH7.2-7.4的PBS或BB：有利于AgAb结合和补体活化。加入适量NacCl:保持等渗和提供Ca2+Mg2+。补体：检测补体：采用新鲜血清。补体结合试验：采用新鲜豚鼠血清。绵羊红细胞：采用2%5%的SRBC悬液。用缓冲液配制。,溶血素SRBC免疫家兔而得到的抗血清。试验前需灭活补体。溶血素稀释：按右表稀释。溶血素效价滴定:确定溶血素的效价(1个溶血素单位）。试验时一般使用2个溶血素单位。,按表将试剂加入试管后，37水浴30min，观察结果。以完全溶血的溶血素最高稀释度为效价，本例中的溶血素效价为14000，即为1个溶血素单位。试验时，用2个溶血素单位（在本例做12000稀释）。,一、CFT试验原理有5种成分参与反应，分属于3个系统：反应系统:即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；补体系统:指示系统:即SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。,Ag,Ab,补体,抗体阳性,待检系统,指示系统,溶血反应,红细胞,溶血素,不溶血,抗体阴性,Ag,Ab,补体,红细胞,溶血素,溶血,补体结合试验,阳性,阴性,二、试验方法较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例:即抗原,抗体,溶血素,羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml，总量为0.6ml。,（一）试剂1抗原：试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。,2抗原和抗体的滴定：多采用方阵法进行滴定,选择适宜的抗原与抗体浓度比例。选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单位）。正式试验中，抗原用24个单位，抗体用4个单位。,抗原和抗体的方阵滴定,注：0表示100%溶血，1表示75%溶血，2表示50%溶血，3表示25%溶血，4表示100%不溶血。,3、补体的滴定：一般用豚鼠补体，补体滴定按下表逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。,（二）血清标本采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于20。血清在试验前应先加热5630min(或603min)以破坏补体和除去一些非特异因素。,血清标本遇有抗补体现象时可做下列处理之一：加热提高12；20冻融后离心去沉淀；以3mmol/L盐酸处理；加入少量补体后再加热灭活；以白陶土处理；通入CO2；以小白鼠肝粉处理；用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。,（三）正式试验-小量法按表逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。,三、方法评价灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05g/ml的抗体,可与间接凝集法的灵敏度相当。特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。试验结果显而易见；易于普及，试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。,补体结合试验可应用在以下几方面：传染病诊断病原性抗原及相应抗体的检测其他抗原的检测例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等自身抗体检测,补体结合试验的缺点：影响因素复杂，操作繁琐且要求严格，稍有疏忽便影响结果；补体性质不稳定，难于标准化；若抗原或待检血清有抗补体作用，则试验难以进行。,第二节补体测定一、补体经典途径活性的测定-血清总补体活性（CH50）测定二、补体旁路途径的溶血活性-（AP-H50）测定,一、血清总补体活性测定（一）50%绵羊红细胞溶血法（CH50）1.实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用，这种活性很容易通过溶血反应进行检测。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一个特殊的S形曲线。,溶血程度与补体含量的关系,在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化不能使溶血程度有显著改变，即溶血对补体量的变化不敏感。在半溶血（50溶血）上下时曲线最陡，即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度也会发生较大的改变，也就是说对补体量的变化非常敏感。故采用50溶血作为终点指标要比100溶血敏感得多，这一方法称为补体50溶血(complementhemolysis50)，简称为CH50。,2.技术要点致敏SRBC：稀释血清:配制50%溶血标准管：加样:结果测定:,致敏SRBC：2单位溶血素与2%SRBC悬液等量混匀，37水浴10min。致敏过程中不时摇动使红细胞保持均匀混悬状。,稀释血清:取新鲜血清稀释。静脉血室温凝固1h，不宜放冰箱凝固，因为补体在0发生冷激活。然后4离心分离血清，避免溶血。0.2ml血清加入3.8ml稀释缓冲液，混匀，即为120血清。,配制50溶血标准管：2%SRBC悬液0.5m1，加入蒸馏水2.0ml，混匀，使SRBC全部溶解；加入1.8%NaCl2m1，使溶液为等渗；再加入2%SRBC悬液0.5m1，混匀，即为50%溶血状态；取该溶液2.5m1，与试验管一起温育，即为50溶血标准管。,结果测定:2500r/min离心5min，观察结果，选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上分别读取吸光度，以最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，取其血清用量、稀释倍数代入下列公式，求得CH50的测定值（单位U）。,血清总补体活性（U/ml）,稀释倍数,1血清用量,3.方法评价CH50试验测定的是经典途径总补体溶血活性，所反应的是补体9种成分的综合水平。方法简便、快速，但敏感性低。影响因素：补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有一定关系。,4.临床意义,总补体活性的参考范围为50100U/mlCH50增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等。CH50降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、急性肾小球肾炎等。,（二）脂质体均相免疫溶破法原理脂质体（liposome）内包有荧光素、有色染料或酶等。表面经修饰可与抗原或抗体偶联，成为致敏脂质体，在与相应抗体或抗原结合后，可经经典途径激活补体，导致脂质体溶破，释放出内容物的量与补体活性成正相关。方法评价简便、快速、准确、血清用量少，适用于自动分析仪测定，易于标准化。,二、补体旁路途径溶血活性(AP-H50)测定（一）原理用乙二醇双氨基四乙酸（EGTA）螯合样品中的Ca2+，封闭C1，阻断补体经典活化途径。EGTA结合Mg2+能力很弱，加入可直接激活血清中B因子的兔红细胞，引起补体旁路途径活化，致使兔红细胞损伤而发生溶血。规定反应时间内，溶血程度与旁路激活的补体活性呈正相关。溶血率与补体旁路溶血活性的关系类似于CH50，故以50兔红细胞溶血为判断终点。,2.技术要点0.5%兔红细胞悬液：用EGTA配制.配制50%溶血标准管：用兔红细胞.稀释血清:用EGTA作1:4稀释加样:结果测定:,结果测定:以出现50%溶血的待检血清最小含量为判断终点，取其血清用量代入下列公式，求得AP-H50的测定值（单位U）。,AP-H50活性（U/ml）,4,1血清用量,3.方法评价测定的是旁路途径溶血活性。方法简便、快速，但敏感性低。兔红细胞易溶血,重复性较差。,4.临床意义,AP-H50活性的参考范围为21.75.4U/mlAP-H50增高见于：肾病综合征、慢性肾炎、肿瘤、某些自身免疫病和感染等。AP-H50降低见于：肝硬变、慢性活动性肝炎、急性肾炎等。,第三节单个补体成分的测定一、免疫溶血法检测某个补体成分的功能和活性。选用先天性缺乏某一补体成分的动物或人血清。检测补体经典途径激活常用CH50、C2、C3和C4。检测旁路途径激活常用AP-H50、B因子和P因子。二、免疫化学法测定其蛋白含量。有单向免疫扩散、火箭免疫电泳和免疫比浊法。,补体含量检测,常用的方法有单向免疫扩散法，火箭免疫电泳，免疫比浊法，酶联免疫吸附试验及放射免疫分析等。但因各组分血清浓度不等，检测方法有所差异。血清含量高的组分如C3、C4、C1q、Bf等可用单向免疫扩散法免疫比浊法等测定。含量低的组分就需用酶联免疫吸附试验等灵敏度较高的方法进行检测。各试验室应根据所采用的检测方法建立自己的参考值。,补体系统固有成分的血清含量(g/L),补体测定的临床意义,由于某些补体成分存在多态性，表型与功能也不尽相同，因此补体活性与含量的测定不能相互取代，应同时测定综合分析。对补体水平进行动态观察。,1