基因表达系统大肠杆菌表达系统.ppt

1,第2节大肠杆菌表达系统,2,IL11MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVAPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL1)分子量、等电点2)信号肽3)糖基化4)蛋白酶裂解位点5)有无二硫键（根据C的数量初步判断）,1了解要目的基因蛋白质的一级结构,http:/www.expasy.ch,3,4,分子量、等电点,5,信号肽,6,7,糖基化,8,蛋白酶裂解位点,9,2分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点atgaactgtgtttgccgcctggtcctggtcgtgctgagcctgtggccagatacagctgtcgcccctgggccaccacctggcccccctcgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctcctggcggacacgcggcagctggctgcacagctgagggacaaattcccagctgacggggaccacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacagctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcagtggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctgcaggcccgactggaccggctgctgcgccggctgcagctcctgatgtcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgcccccgctggcgcccccctcctcagcctgggggggcatcagggccgcccacgccatcctgggggggctgcacctgacacttgactgggccgtgaggggactgctgctgctgaagactcgg,10,/,11,12,3选择合适的表达系统,查看表达载体图谱及特性插入位点是否合适融合标签是否合适,13,14,15,目的基因(IL11)引物设计,xxxxxxatgaactgtgtttgccgcctggtcctggtcgtgctgagcctgtggccagatacagctgtcgcccctgggccaccacctggcccccctcgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctcctggcggacacgcggcagctggctgcacagctgagggacaaattcccagctgacggggaccacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacagctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcagtggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctgcaggcccgactggaccggctgctgcgccggctgcagctcctgatgtcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgcccccgctggcgcccccctcctcagcctgggggggcatcagggccgcccacgccatcctgggggggctgcacctgacacttgactgggccgtgaggggactgctgctgctgaagactcggxxxxxx,16,PCR扩增基因,RNA,设计表达引物,准备模板,PCR,纯化,酶切,纯化,17,PCR技术克隆基因,18,PCR反应组分,94C294C3055C4572C172C10,50lvolumeDistilledWaterXl10Xbuffer5l2.5mMdNTP4l25MmMgCl23lTemplate1lForwardPrimer1lReversePrimer1lTaq酶0.25l加热盖,35,热起动,DMSO,19,酶切反应,1l10 xbuffer（H，M，L）1l限制性内切酶4lDNA(PCR产物,质粒)4l灭菌水Mix37，1-2h,双酶切EcRI,XhoI,20,琼脂糖电泳检测质粒是否切开,21,纯化酶切后的PCR产物、质粒酚氯仿抽提,或用kit纯化,酚/氯仿抽提法纯化DNA的步骤如下：1、向酶切样品中加入灭菌水至总体积为100L；2、加入等体积的酚/氯仿，涡漩；3、10,000rpm，5min；4、转移上清至新的离心管中（应避免吸取中间层的蛋白）；5、加入上清体积1/10的3M乙酸钠（pH5.2）和两倍总体积的100的乙醇，冰浴30min。6、4离心，10,000rpm，10min；7、去上清，加100L70乙醇，洗涤沉淀；8、10,000rpm离心2min，去乙醇；9、再离心1min，去乙醇；10、真空干燥，完全去除乙醇以后，重溶于10L灭菌水中，20保存，备用。,22,连接反应10l,Xl载体XlDNAXlddWater1l10XT4连接酶buffer1lPEG1lT4DNA连接酶,23,PCR筛选，酶切确认，提取质粒测序,连接、转化克隆质粒,24,转化宿主细胞,1l重组载体+10l水50l感受态细胞（冰浴中）冰水中30min42水浴75sec加入1mlLB液体培养基混匀,37水浴，1h6,000rpm，2min去掉大部分上清液留100l左右,悬起细胞涂平板,LB平板抗生素半开盖，3715min,37，倒置平板过夜,25,挑选菌落,保种,PCR检测,或测序,26,1.大肠杆菌染色体DNA分子量很大。在提取质粒过程中，染色体DNA往往断裂成线状大分子；质粒的分子量较小，是共价闭合环状的超螺旋DNA。2.当细胞用碱裂解时(pHl2.012.6)，线状DNA发生变性，共价闭环的质粒DNA不发生变性。3.在高盐浓度下将裂解液pH恢复至中性时，变性了的染色体DNA交织成网状而发生沉淀，可以用离心的方法除去染色体DNA沉淀物。共价闭环的质粒DNA不发生沉淀,留在离心上清液中。4.用有机溶剂沉淀出质粒DNA。,提取质粒原理及方法,27,1.培养细胞,加抗生素2.收集细胞,14,000g,1min.3.悬浮细胞于0.3mlofSolutionI15mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA,100g/mlRNaseA.碱变性Add0.3mlofSolutionII(0.2NNaOH,1%SDS),gentlymix,Incubateatroomtemperaturefor5min.Note:Theappearanceofthesuspensionshouldchangefromveryturbidtoalmosttranslucent.,28,4.高盐、复中，Slowlyadd0.3mlof3Mpotassiumacetate(pH5.5),mixinggentlyduringaddition.AthickwhiteprecipitateofproteinandE.coligenomicDNAwillform.Placethesampleonicefor5to10min.5.离心Centrifugefor10minat14,000g.,29,6.沉淀Gentlytransferthesupernatanttothetubecontainingisopropanol.Avoidanywhiteprecipitatematerial.Mixbygentlyinvertingtubeafewtimesandplaceonicefor5to10min.7.收集DNA，Centrifugethesamplefor15minat14,000gatroomtemperature.,30,8.洗涤,70%ethanoltoeachtube.Invertthetubeseveraltimestowashthepellet.Centrifugefor5minat14,000gatroomtemperature.9.去上清液10.风干5to10minatroomtemperatureanddissolvetheDNAin40lTE.,31,SDS-PAGE检测表达情况,试表达,32,EcoRI/XhoI双酶切,转化宿主菌BL21BL21(DE3)JM109,RNA,33,工作进程,第一天,PCR扩增基因摇质粒菌第二天,提质粒纯化PCR产物和质粒酶切,纯化连接第三天,转化第四天,挑菌株检测,保种过夜培养第五天,转培养,诱导表达第六天,SDS-PAGE检测,34,35,各种类型原核表达系统的构成和特点,融合表达外源基因与载体上的一段蛋白质编码基因形成一个读框,表达出融合蛋白融合表达特别注意：*表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！*如果表达后要切去标签，需要在构建载体前检查目的蛋白中有无相同的蛋白酶裂解位点。,36,pGEX,pGEX2T复制子筛选标