流式细胞仪.ppt

流式细胞术原理与应用简介,湖北中医学院中医药实验中心田代志,流式细胞术发展史,1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年WallaceCoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞,流式细胞术发展史,1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪,流式细胞术发展史,目前国内主要流式细胞仪厂家：BecktonDickinson(BD)公司BACKMANCOULTER公司,流式细胞仪构造,流式细胞仪(FlowCytometer，FCM)的结构分五部分：流动室及液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与存贮、显示、分析系统细胞分选及浓缩系统流式细胞术(FlowCytometry，FCM)图示如下页：,流式细胞仪构造模式图,流式细胞仪构造示意图,流动室与液流驱动系统,流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,流动室与液流驱动系统,激光光源及光束成形系统,目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约2266m的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。,激光光源及光束成形系统,光学系统,FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要光学原件：滤光片(Filter)长通滤片LongPassFilter,LP短通滤片ShortPassFilter,SP带通滤片BandPassFilter,BP,长通滤片,短通滤片,带通滤片,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发光光源波长488nm为例示意图：,荧光信号示意图,散射光信号,散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。前向散射角(ForwardScatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。侧向散射角(SideScatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。散射光信号波长与激光相同。,散射光信号示意图,荧光信号,一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。,常用荧光染料,目前台式机FCM配置488nm激光管常用染料有PI(PropidiumIodide)PE(Phycorey-thrin)FITC(FluoresceinIsothiocyanate)PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-CY5等633nm激光管常用染料有APCAPC-Cy,FCM测量数据的存贮、显示和分析,目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：直方图散点图等高线图密度图三维图,直方图,直方图(DistributionHistogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图(DotPlot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,设门分析,可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。,FCM的分辨率,分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV670nmFL4：653-667nm技术参数分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。常用荧光染料光谱学特征,细胞周期分析PI单染,细胞周期分析PI单染,细胞周期分析ModiFit分析,细胞周期分析ModiFit分析,大鼠生精细胞分析PI单染,细胞凋亡PI加AnnexinV双染,FITC-AnnexinV,PI,淋巴细胞亚群分析,CY5.5-CD3,FITC-CD4,PE-CD8,培养细胞表面粘附分子表达,培养细胞表面粘附分子表达,FCM样品来源,需要制备细胞悬液血液、体液等液体样品培养的细胞活体组织样品冰冻组织固定的组织样品,直接应用分离后使用,样品制备,细胞分离方法直接离心沉淀物理方法分离（超声波、筛网等）酶消化如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离,样品染色步骤,PBS洗细胞12次加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟如果必需，加荧光二抗，暗处孵育1530分钟PBS洗细胞一次过300目尼龙网上机检测,PI单染测细胞凋亡步骤,制备细胞悬液PBS洗细胞1次，1000rpm离心10min，去上清。加PI染液（含PI50mg/ml,Rnase50ug/ml)，暗处孵育30分钟过300目尼龙网上机检测,淋巴细胞亚群分析实验步骤,采集血液样品取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体20l至E