药物的鉴别试验课程最终修改分析.ppt

第二章药物的鉴别试验,分析检测教研室,2,第一节概述,药物鉴别试验的意义与目的问题：鉴别的定义是什么？,3,药物的鉴别试验（identificationtest),是根据药物的分子结构、理化性质,采用化学、物理化学或生物学方法来证明已知药物的真伪。是药检工作的首要任务，杂质检查、含量测定的前提。,4,注意：,药物鉴别试验是用来证实贮藏在有标签容器中的药物是否为其所标示的药物，而不是对未知物进行定性分析，因为这些鉴别试验虽有一定的专属性，但不具备进行未知无确证的条件，故不能鉴别未知物,5,第二节鉴别试验的项目,性状一般鉴别试验专属鉴别试验,6,一、性状,外观：感观规定，一般性的描述。如二巯基丁二钠的描述为“本品为白色至微黄色的粉末；有类似蒜的特臭”。溶解度：反映了在某种溶剂中的溶解性能。物理常数:评价药品质量的重要指标，反映药品的纯净程度。熔点、比旋度、吸收系数、凝点、折光率、相对密度、馏程、黏度、酸值、皂化值、羟值、碘值等,7,1.外观：指药品的外表感观和色泽，包括聚集状态、晶型、色泽以及臭、味如：维生素B1“本品为白色结晶或结晶粉末；有微弱的特臭，味苦；干燥品在空气中迅即吸收约4%的水分”,8,极易溶解系指溶质1g(ml)能在溶剂不到1ml中溶解；易溶系指溶质1g(ml)能在溶剂1不到10ml中溶解；溶解系指溶质1g(ml)能在溶剂10不到30ml中溶解；略溶系指溶质1g(ml)能在溶剂30不到100ml中溶解；微溶系指溶质1g(ml)能在溶剂100不到1000ml中溶解;极微溶解系指溶质1g(ml)能在溶剂1000不到10000ml中溶解；几乎不溶或不溶系指溶质1g(ml)在溶剂10000ml中不能完全溶解。,2.溶解度试验法：供试品准确称取研成细粉在252，加溶剂每隔5min振摇30s无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解,9,（1）熔点1）定义：Ch.P规定,熔点系指一种物质由固体熔化成液体的温度、熔融同时分解的温度，或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。如：雌二醇：175180醋酸地塞米松：223233,3.物理常数,样品,发毛,收缩,液滴（初熔）,澄清（全熔）,10,2）测定方法分三法：第一法：测定易粉碎的固体药品如各种结晶型药物第二法：测定不易粉碎的固体药品如脂肪、石蜡、羊毛脂第三法：测定凡士林或其他类似物质（详见：Ch.P2010年版二部附录C）,11,温度计分浸型，具有0.5刻度，须先经校正,传温液m.p80水m.p80硅油或液状石蜡,注意事项：,12,（2）相对密度1)基本原理相对密度系指在共同的特定条件下(如同一温度等)，某物质的密度与另一参考物质的密度之比。,3.物理常数,13,中国药典要求在相同条件下，液体药物比纯化水重的倍数，除另有规定外，温度均指20时的比值。纯药物的相对密度在特定条件下为不变的常数，药物的纯度改变，相对密度也随之改变，所以测定相对密度，可以区别或检查药物的纯杂程度。,14,2)相对密度测定方法,20液体药物密度/水密度,供试品用量少较常用,仅用于易挥发液体,15,比重瓶法,16,新沸约20的水精密称定重量,20水浴放置1020min迅速精密称定,比重瓶洗净、干燥带塞精密称定,比重瓶法,17,韦氏比重称法,18,应用举例：,19,1.我国药典规定“熔点”的含义系指固体A.自熔化开始点到液化点B.自熔化开始点到崩坍点C.自收缩点到液化点D.自崩坍点到液化点E.自熔化开始点到熔化澄明点,练习,20,中国药典规定“熔点”系指A.固体初熔时的温度B.固体全熔时的温度C.供试品在毛细管内收缩时的温度D.固体熔化时自初熔至全熔的一段温度E.供试品在毛细管内开始局部液化时的温度,21,1）基本原理反映手性药物特性及其纯度的主要指标。,（3）旋光度,不对称碳原子,HRCRCH3,手性碳原子,具有光学活性,3.物理常数,22,葡萄糖,23,旋光度直线偏振光通过含有某些光学活性的药物液体时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转，旋转的度数称为旋光度。偏振光向右旋转者（顺时针方向）为右旋，以“”符号表示；使偏振光向左旋转者(反时针方向)为左旋，以“”符号表示,24,钠光谱D线（589.3nm）,比旋度测定管长为1dm、浓度为1g/ml时测得的旋光度,25,计算,液体供试品,26,固体供试品,27,2）旋光仪的检定,旋光管标准石英旋光管,基准物蔗糖,28,A、比旋度的测定中国药典许多药物（如硫酸奎宁、肾上腺素、葡萄糖等）的性状项下规定了比旋度的测定，既判别了药物的真伪，又检查了药物的纯度,应用举例,29,B、在杂质检查中的应用如硫酸阿托品中莨菪碱的检查,C、在含量测定中的应用如葡萄糖注射液的含量测定,30,1：旋光计的检定，中国药典（2000年版）规定用A、葡萄糖作基准物B、水杨醛作基准物C、半乳糖作基准物D、水合氯醛作基准物E、蔗糖作基准物,练习,31,2.测定盐酸土霉素的比旋度时，若称取供试品0.5050g，置50ml量瓶中，加盐酸液（91000）稀释至刻度，用2dm长的样品管测定，要求比旋度为188200。则测得的旋光度的范围应为A、3.804.04B、380404C、1.902.02D、190202E、1.882.00,32,33,3.测定某药物的比旋度，配制的供试品溶液浓度为50.0mg/ml，样品溶液宽2dm，测得旋光度为+3.25，则比旋度为A.+6.50B.+32.5C.+60.0D.+16.25E.+325,34,4.旋光度测定法可检测的药物是A.具有立体结构的药物B.含有共轭系统结构的药物C.脂肪族药物D.结构中含手性碳原子的药物E.结构中含氢键的药物,35,5.比旋度的符号应是A.B.CD.PaE.dm,36,6.旋光计的检定，中国药典（2010年版）规定用A.葡萄糖作基准物B.水杨醛作基准物C.半乳糖作基准物D.水合氯醛作基准物E.标准石英旋光管,37,7.可用旋光度法测定的药物是A、对氨基水杨酸B、氯丙嗪C、氯氮卓D、葡萄糖注射液E、盐酸利多卡因,38,（4）吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度称为吸收系数。表示方法：摩尔吸收系数百分吸收系数用途：检查纯度测定制剂含量,3.物理常数,39,二、一般鉴别试验（generalidentificationtest）,Ch.P附录中有：有机氟类、有机酸盐类（水杨酸盐）、芳香第一胺类、托烷生物碱类、丙二酰脲类无机金属类（Na+,K+,Ca2+,Ba2+,Li+,Fe3+,Al3+,Zn2+,Cu2+,Ag+,Hg2+等）无酸盐类(Cl-、SO42-、NO3-),40,一般鉴别试验（generalidentificationtest）,是指依据某一类药物的共同的化学结构或相同的理化特性，来鉴别药物的真伪。有机药物-官能团无机药物-阴离子、阳离子一般鉴别试验用于证实药物是哪一类，要进一步证实是哪一种药物，还需要结合专属鉴别试验,41,1.有机氟化物,有机氟,氧瓶燃烧,无机氟离子,pH4.3,茜素氟蓝,硝酸亚铈,蓝紫色络合物,碱液吸收,一般鉴别试验的典型实例,42,药典原文,43,2.有机酸盐(1)水杨酸盐P65,水杨酸+FeCl3,中性条件,弱酸性条件,红色配位化合物,紫色配位化合物,6+4FeCl3,+12HCl,水杨酸盐+稀盐酸水杨酸（白色沉淀）,溶于醋酸铵,一般鉴别试验的典型实例,44,一般鉴别试验的典型实例,（2）苯甲酸盐,碱式苯甲酸铁盐（赭色沉淀）,稀盐酸,白色,B.苯甲酸盐在干燥试管中，加硫酸后，加热，析出苯甲酸晶体并具有升华现象。,A.苯甲酸盐在中性或碱性溶液中与三氯化铁生成赭色铁盐沉淀，沉淀加稀盐酸后分解，苯甲酸游离成白色沉淀析出。,45,供试品,+,稀盐酸0.1mol/L亚硝酸钠碱性-萘酚试液,橙黄色到猩红色沉淀,3.芳香第一胺类,一般鉴别试验的典型实例,46,反应原理：,-奈酚试液要现用现配,不同的供试品，会生成橙黄色到猩红色沉淀,47,药典原文,鉴别方法：取供试品约50mg，加稀盐酸1ml，必要时缓缓煮沸使溶，放冷，加亚硝酸钠溶液（0.1mol/L）数滴，滴加碱性-萘酚试液数滴，视供试品不同，生成橙黄色到猩红色沉淀。,48,4.无机金属盐（Na,K,Ca,NH4+)P1112焰色反应：Na显鲜黄色；K显紫色；Ca显砖红色铵盐：,供试品,+NaOH,氨气,一般鉴别试验的典型实例,49,50,5.无机酸根氯化物：Cl-+Ag+AgCl白色乳状Cl-+MnO2Mn2+Cl2硫酸盐：SO42-+Ba2+BaSO4白色SO42-+Pb2+PbSO4白色加盐酸，无白色沉淀,H2SO4,使湿润的KI_淀粉试纸变蓝,一般鉴别试验的典型实例,51,三、专属鉴别试验（specificidentificationtest）,是证实某一种药物的依据。根据同类药物中每一种药物化学结构的差异理化特性，选用某些特有的灵敏的定性反应，来鉴别药物的真伪。方法收载于药典正文或国家药品标准各药品质量标准鉴别项下。,52,共性丙二酰脲-CONHCONHCO-可与某些金属离子（Ag+、Cu2+、Hg2+等）反应呈色或产生沉淀,巴比妥类药物,+2AgNO3,+2HNO3,一般鉴别试验,53,与Pb2+反应生成黑色PbS,甲醛硫酸反应,碘取代反应,专属鉴别试验,硫喷妥钠,司可巴比妥,苯巴比妥,54,专属鉴别,一般鉴别试验与专属鉴别试验的差别？,一般鉴别试验：共同化学结构具有相同的物理化学性质来进行药物真伪的鉴别。专属鉴别试验：在一般鉴别试验的基础上，利用各种药物的化学结构差异来鉴别。一般鉴别试验：区别不同类别的药物。专属鉴别试验：区别同类药物或具有相同化学结构中的某一个药物。,1）理论依据不同：,2）目的不同：,55,第三节鉴别方法,一、化学鉴别法二、光谱鉴别法三、色谱鉴别法,56,一、化学鉴别法供试品加入适当的试剂，在一定条件下，发生化学反应，通过产生可观测到的明显现象，来鉴别药物真伪的方法。化学鉴别法特点操作简便、反应快速、实验成本低、应用广但专属性比仪器分析法差分为：1.呈色反应鉴别法2.沉淀生成反应鉴别法3.荧光反应鉴别法4.气体生成反应鉴别法5.试剂褪色的鉴别法,57,一、化学鉴别法1.呈色反应鉴别法供试品加入适当的试剂，在一定条件下，反应生成有色产物,三氯化铁呈色反应（酚羟基）,有机氟化物的茜素氟蓝法,芳香第一胺类重氮化-偶合反应,58,2.沉淀生成反应鉴别法供试品加入适当的试剂，在一定条件下，反应生成沉淀,还原性基团的银镜反应,丙二酰脲类的硝酸银反应,氯化物的银盐沉淀,苯甲酸盐类的三氯化铁反应,生成氧化亚铜红色沉淀反应,与重金属离子的沉淀反应,一、化学鉴别法,59,3.荧光反应鉴别法药物本身在可见光下发射荧光如：维生素B2溶液显蓝色荧光药物与适当试剂反应后发射荧光如：,一、化学鉴别法,60,4.气体生成反应鉴别法大多数伯胺（铵）类药物、酰尿类以及某些酰胺类药物，可经强碱处理后加热产生氨气。红色石蕊试纸变蓝硝酸亚汞试液湿润的试纸显黑色,一、化学鉴别法,61,化学结构含硫药物，可经强酸处理后加热产生硫化氢气体,硫鸟嘌呤,7H2O,强酸,H2S,（臭鸡蛋气味）使醋酸铅试纸变黑,62,含碘有机药物经直火加热可生成紫色碘蒸汽,含醋酸酯和乙酰胺类的药物，经硫酸水解后，加乙醇可产生醋酸乙酯的香味。,63,一、化学鉴别法,5.试剂退色维生素C与二氯靛酚反应,64,（6）测定生成物熔点法制备衍生物测定熔点法药物试剂新化合物有一定mp;药物酸化或碱化生成游离酸或碱。操作繁琐费时间，应用较少。,一、化学鉴别法,65,1.紫外光谱（UV）2.红外光谱（IR）,二、光谱鉴别法,66,二、光谱鉴别法1.紫外光谱,是通过测定药物在紫处-可见光区（200760nm）的吸收光谱特征对药物进行鉴别的方法。用紫外光源测定无色物质的方法-紫外分光光度法；紫外光的波长范围是200400nm用可见光光源测定有色物质的方法-可见光光度法。可见光400760nm,67,1）测定原理：,含有共轭体系的有机药物在紫外-可见光区有特征吸收，可根据药物的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、最大吸收波长、吸收峰数目、各吸收峰的位置、强度和相应的吸收系数等进行分析，最大吸收波长和吸收系数是鉴别药物的常用参数。紫外光谱法操作简便、快速。用作鉴别的专属性远不如红外光谱法。紫外光谱相同的物质不一定是同一种物质。,68,2）紫外光谱法鉴别常用的方法,测定最大吸收波长，或同时测定最小吸收波长；规定浓度的供试液在最大吸收波长测定吸收度；规定吸收波长和吸收系数法；规定吸收波长和吸光度比值法；经化学处理后,测定其反应产物吸收光谱特性以上方法可单用，也可几个结合起来使用，以提高专属性,69,测定最大吸收波长,或同时测定最小吸收波长,布洛芬全波长扫描图,70,规定吸收波长和吸光度比值法,两性霉素在362nm、381nm、405nm波长处有最大吸收.规定362nm/381nm处吸光度比值不大于0.6381nm/405nm波长比值不大于0.9VB12361nm/278nm1.701.88361nm/550nm3.153.45,71,与对照品比较,对比吸收光谱的一致性,72,规定浓度的供试液在最大吸收波长测定吸收度；Ch.P示例一盐酸布比卡因的鉴别试验0.40mg/ml：max:263nm、271nmA:0.530.58;0.430.48规定一定浓度的供试液在最大吸收波长处的吸光度示例二地蒽酚的鉴别试验max:257nm、289nm、356nmA257/A289=1.061.10A356/A289=0.900.94规定最大吸收波长和吸光度比值法,73,示例氯贝丁酯的鉴别试验0.10mg/mlmax:280nm、288nm10g/mlmax:226nm,规定一定浓度下的供试液的最大吸收波长,74,USP采用对照品法供试药与其对照品按同一方法处理，在同样条件下紫外光谱图一致。BP规定一定波长范围内，仅有一个最大或最小吸收JP与Ch.P相似,3）各国紫外鉴别法比较,75,2.红外光谱法1）原理IR光谱法是有机药物分子的振动-转动光谱，能反映药物分子的结构特点，分子中每个基团一般都由相应的吸收峰，且特征性强，（除光学异构体及长链烷烃同系物外）几乎没有两种化合物具有完全相同的红外吸收光谱，即红外吸收光谱具有“指纹性”，被广泛地应用于化合物的鉴别。专属性强、准确度高的特点，应用广（固、液、气）主要用于组分单一、结构明确的原料药以及结构相近的同类物质。,二、光谱鉴别法,76,特征区40001300cm-1疏，易辨认,指纹区1300400cm-1密，高度敏感,77,标准图谱法：Ch.P要求按指定条件绘制供试品的红外光吸收图谱，与药品红外光谱集中的相应标准图谱对比，如果峰位、峰形、相对强度都一致时，即为同一种药物。对照品法：将供试品与对照品在同样的条件下绘制红外图谱，彼此对比是否一致的方法。可消除不同仪器和操作条件造成的误差。,2）红外光谱法鉴别常用的方法,78,3）试样的制备方法,压片法,供试品（约1mg)+干燥KBr/KCl(约200mg),均匀透明片无明显颗粒供试片,同法制空白KBr/KCl片，做空白校正，扣除背景干扰,79,糊法,供试品（约5mg）,滴加少量液体石蜡或其他液体,制成糊状物,玛瑙研钵,取适量夹于两个KBr片（150mg/片）之间,供试片,KBr（约300mg）制成空白片，作背景校正,80,4）各国红外光谱法比较,Ch.P采用标准图谱对照法BP采用标准图谱对照法、对照品法USP采用对照品法JP规定条件下测定一定波长处特征吸收峰。,81,三、色谱鉴别法利用不同物质在不同的色谱条件下，产生各自的特征色谱行为（保留时间，比移值）进行的鉴别试验。常采用对比法与对照品、已知药品，在相同条件下进行色谱分离并比较。TLCHPLCGC,82,三、色谱鉴别法1.薄层色谱鉴别法(TLC)1)原理薄层色谱法具有专属性强、操作简便、实验成本低等优点。在鉴别试验中，薄层色谱法是色谱法中应用最广的一种方法。Ch.p（2010）一部，4000项左右。通过Rf值，斑点颜色进行定性。,83,2）薄层色谱鉴别基本操作薄层板的制备：薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。,薄层板活化：不同薄层活化条件略有不同，如：硅胶1101h氧化铝11030min,点样：药典规定：点样基线距底边2.0cm，样点直径24mm，点间距离约为1.5-2.0cm。要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。,饱和及展开：点样并将样品点晾或吹干后，先将板放入展开室内，但不要浸入展开剂，预先饱和一段时间，再放入展开剂展开（一般上行），薄层板水平角度以75为最佳。展开距离一般为10-15cm。,（5）检视：物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭化学方法加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。,84,三、色谱鉴别法2.HPLC、GC色谱分析法供试品和对照色谱峰保留时间一致。在鉴别试验中，通常含量测定同时用于鉴别的一种方法。,85,色谱谱鉴别法小结,适用于复杂环境下药物有效成分及杂质鉴别,具有分离、分析同时进行的特点.高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)供试品和对照品色谱峰保留时间一致.薄层扫描法(TLC)对照品比较法，供试品斑点与对照品的Rf值及斑点的颜色应一致.,色谱法（HPLCGCTLC),86,四、药物鉴别方法新动向,1、仪器方法用于药物鉴别的数量大大增加，USP、BP仪器鉴别法：化学鉴别法（2:1）BP：主要用TLCUSP：HPLC2、原料广泛采用IR法鉴别,87,第四节鉴别试验条件,一、溶液的浓度溶液的浓度主要指被鉴别物质的浓度，其大小影响结果的判断。（如化学法