裸鼠成瘤慢病毒感染后的细胞ppt课件.ppt

裸鼠皮下成瘤-慢病毒感染后的细胞,1,裸鼠,无胸腺裸鼠（NudeMouse，简称裸鼠）。目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。特别是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面，它有着特殊的价值。裸鼠（纯合子nu/nu突变鼠）主要表现为无毛（但可看到一种细毛组织学证明有被毛滤泡）以及缺乏正常胸腺。杂合子小鼠（nn/+）各方面表现都正常。小鼠中有若干突变基因，它可产生一种为无毛的表现型（phenotype），例如无胸腺裸鼠（Nude）、裸鼠（Naked）、无毛鼠（Hairless）、无鼻毛鼠（Rhinol），不要把这些突变鼠基因相互混淆。裸鼠的唯一特性是胸腺缺陷表现型，因此，不能将“裸鼠”与“无毛鼠”两词交换使用。,2,裸鼠,裸小鼠,裸大鼠,3,裸小鼠(基因符号nu):无毛(hairless),无胸腺(athymus).幼鼠(34周龄),成年鼠(68周龄。抵抗力差，易在SPF环境下可生存，所用的笼具、垫料、饲料、饮水患病毒性肝炎和肺炎，因而饲养和繁殖要求条件比较严格，等都要求经过严密灭菌消毒并采用隔离器饲养，以保证长期存活并进行繁殖。裸大鼠(基因符号rnu)：一般特征似裸小鼠，但躯干部仍有稀少被毛并非象裸小鼠那样完全无毛，头部及四肢毛更多。裸大鼠易患呼吸道疾病。,形态特征,4,虽然说以裸大鼠代替裸小鼠，具有移植肿瘤大，取血量多，可行某些外科小手术等优点。因此比裸小鼠有一定优越性，其缺点是维持经费比裸SPF小鼠更高，另外裸大鼠目前不怎么流行。所以我们实验室常用的是BALB/c-nu裸小鼠。随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸鼠体内正常T细胞会增加，故接种肿瘤实验一般采用4-6周龄的裸鼠。,裸鼠的选择,5,1.人体原发癌,我们实验室均采用细胞株作为材料，这个方式是性价比最高的，操作简便，材料安全且容易获取。,结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。,裸鼠成瘤,2.建株的人体肿瘤组织培养细胞,裸鼠成瘤方式,理论上建株的肿瘤细胞均可以,6,细胞的选择大致有一下几个方面：1.国际公认度较高的细胞株。2.根据体内生长情况来确定，很多细胞株，在文献中有很高的出镜率，但是实际上，基本都是从体外开始有名。,细胞株的选择,当然，我们对于细胞株的选择是没有选择的！,7,常规较容易成瘤的细胞：Hep-G2（肝癌，Hep2（喉癌），NCI-H460(大细胞肺)，A431(表皮癌),SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌），A375/B16-F10（人黑色素瘤细胞）。,可以成瘤但是比较慢的细胞：CNE（鼻咽癌），A549（肺癌），SPC-A-1（肺腺癌）。HT-29（结肠癌），EL-7402（肝癌）。,一些比较有争议的细胞：Hela（宫颈癌），HCT（人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞）。,常见的细胞株,8,1、慢病毒保存理论上慢病毒可在-80保存6个月，在4可保存3天。因为慢病毒每次冻融会降低病毒滴度10%，因此慢病毒实验最好是提前分装。2、MOI值细胞感染达到80%以上所需MOI值，这个大部分细胞是可以查到，不过因为因为慢病毒感染细胞是很灵活的，因此MOI值的选择也是很有差异性的，具体情况具体分析。,细胞慢病毒感染,9,附：慢病毒使用量的相关计算公式,MOI=（慢病毒使用的体积*慢病毒滴度）/需要感染的细胞数其中：慢病毒使用体积单位为ml慢病毒滴度单位为TU/ml例如：Hep-G2细胞，MOI=20，慢病毒滴度=1.0*108TU/ml,24孔板的细胞总数：2.0*105个。因此：感染24孔板中1孔的HEP-G2细胞所需要的慢病毒体积为：(20*2.0*105)/1.0*108=0.04ml,细胞慢病毒感染,10,附：一些细胞的慢病毒感染效果图K562A549,细胞慢病毒感染,11,细胞培养：细胞的状态以及数量是裸鼠皮下成瘤很关键的一步。细胞状态良好，对数生长期，接种很容易形成肿瘤，反之则会导致失败。即浪费了细胞，又错过了裸鼠成瘤的最佳时期,裸鼠成瘤,-+,12,裸鼠成瘤,细胞接种：接种的细胞量：无血清培养基重悬成1*107个/ml的悬液，0.2ml/只/针。也就是一只裸鼠最少要用200W个细胞，有的细胞需求可能会达到1000W个/只。接种的部位大部分颈部和腋下皮下。血丰富，能提供大量的营养。当然，这个也是可以调整的。另外裸鼠理论上是1个裸鼠只能接种1针，形成1个肿瘤。因为2个或者以上的肿瘤是会相互影响的。,13,附：我们实验一些裸鼠成瘤的成功案例,Hep-G2细胞A375细胞,裸鼠成瘤,14,裸鼠皮下成瘤后，除了一些常规的检测外我们一般可进行以下一些实验操作：,裸鼠活体荧光,一些其他情况下的裸鼠成瘤,15,1