课题3血红蛋白的提取与分离自制.ppt

课题3血红蛋白的提取和分离,(一）蛋白质,占细胞干重的50以上，细胞中含量最多的有机物,2、组成元素,C、H、O、N,一、基础知识,1、含量,3、相对分子质量,高分子化合物,4、基本组成单位,氨基酸,5、氨基酸通式,6、氨基酸连接方式,脱水缩合,写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图,氨基酸的结合方式,C,H,COOH,R1,C,H,NH2,COOH,R2,NH2,C,O,H,N,H,OH,氨基酸的结合方式,C,H,R1,NH2,OH,C,O,H2O,H,氨基酸的结合方式:,C,H,R1,NH2,C,O,H2O,二肽,肽键,脱水缩合,氨基酸的结合方式:脱水缩合,肽键,OH,H,二肽,H2O,H2O,氨基酸的结合方式:脱水缩合,肽键,二肽,H2O,肽键,三肽,以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。,H2O,8、分子结构,7、肽键,10、生理功能,细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者,氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别,9、蛋白质结构的多样性,氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个,若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成_个肽键,脱去_个水分子，至有氨基和羧基各_个,11、相关计算,n-m,n-m,m,蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构,关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为_,na-(n-m)18,课题3血红蛋白的提取和分离,思考1分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异,分子的形状和大小,所带电荷的性质和多少,溶解度,分离不同蛋白质,思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考4人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,一、凝胶色谱法原理,一些微小多孔的球体,内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成的如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛,什么是凝胶？,原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,缓冲溶液的配制,调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。,(1)0.2mol/L的Na2HPO4溶液,将71.64g的Na2HPO412H2O溶解在1000mL的蒸馏水中,(2)0.2mol/L的NaH2PO4溶液,将31.21g的NaH2PO42H2O溶解在1000mL的蒸馏水中,0.2mol/L,NaH2PO4/mL,0.2mol/L,Na2HPO4/mL,0.2mol/L,0.2mol/L,NaH2PO4/mL,Na2HPO4/mL,思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,二、电泳的原理,概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,待分离样品中各种分子,带电性质的差异,大小、形状的不同,带电分子产生不同的迁移速度,1、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于等因素。,分子的大小,它所带静电荷的多少以及分子的大小,2、SDS：,十二烷基硫酸钠,为了消除静电荷对迁移率的影响,SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。,电泳检测PCR结果,课堂小结：,1、凝胶色谱法原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,待分离样品中各种分子,带电性质的差异,大小、形状的不同,带电分子产生不同的迁移速度,2、凝胶电泳原理,二实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理和粗分离,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（）,两个a肽链,两个一肽链,样品处理和粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,亚铁血红素集团,红细胞的洗涤,样品处理和粗分离,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。,第1层（最上层）：（）甲苯层,第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体,第3层（中下层）：（）的水溶液层（）的液体,第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,用滤纸过滤，除去红细胞破碎物沉淀，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,利用透析袋透析,二、凝胶色谱纯化,2.凝胶色谱制作,1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。,2）凝胶色谱柱填料的处理,（1）凝胶的选择：（）（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。,蒸馏水,凝胶悬浮液,交联葡聚糖凝胶,固定：将色谱柱处置固定在支架上,装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,（3）凝胶色谱柱的装填方法,凝胶悬浮液,色谱柱,洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。,洗涤平衡,50cm,3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,加透析样品,注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动,调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,实验录像,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。,思考,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,三、纯度鉴定,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,纯化,实验录像,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三实验结果分析与评价,注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,讨论：如何测定蛋白质的分子量？,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细