（麻醉学专业论文）利多卡因对急性肺损伤中肺组织细胞凋亡的影响.pdf

-l徐州医学院硕士学位论文嬲嬲燃缩略词a ia l i英文全称a p o p t o t i ci n d e xa c u t el u n gi n j u r y缩略词表a b b r e v i a t i o n凋亡指数急性肺损伤中文全称a r d sa c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e急性呼吸窘迫综合征b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白b c i p5 - b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y lp h o s p h a t e5 一溴一4 - 氯一3 一吲哚磷酸盐d a bd i a m i n o b e n z i d i n e二氨基联苯胺d i s cd e a t hi n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x死亡诱导信号复合物f a d df a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i nf a s 相关死亡结构域f c ml p sn cn f r d 3f l o wc ”o m e t r y流式细胞计数l i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖n i t r o c e l l u l o s en u c l e a rf a c t o rk b硝酸纤维素核因子1 ( bp a g ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳p b sp h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n磷酸盐缓冲溶液p m np o l y m o r p h o n u c l e a rl e u c o c y t e多形核白细胞s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠t u - n e lt d t - m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n g 脱氧核苷酸末端转酶介导的缺口末端标记t b s tt r i sb u f f e r e ds a l i n et w e e n 2 0t r i s 缓冲液吐温2 0t n f - r 1t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o rt y p e1肿瘤坏死因子受体1徐州医学院硕士学位论文利多卡因对急性肺损伤中肺组织细胞凋亡的影响中文摘要目的观察利多卡因对脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 诱导的急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y , a l i ) 模型中肺组织细胞凋亡的抑制作用，并初步探讨其可能的分子机制。方法雄性s d 大鼠4 8 只，随机分为四组，生理盐水组( n _ 6 ) ，l p s 组( n = 1 8 ) ，利多卡因+ l p s 组( n = 1 8 ) ，利多卡因组( n ) 。其中l p s 组和利多卡因+ l p s 组在给予l p s 处理后随机分为6h ，1 2h ，2 4h 三个亚组，每个亚组6 只大鼠。检测大鼠肺组织湿干重比，以及肺组织病理学改变。凋亡肺组织细胞的检测应用脱氧核苷酸转移酶末端标记( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y it r a n s f e r a s e - m e d i a t ed u t pn i c k - e n dl a b e l i n g ，t u n e l ) 技术，在显微镜下观察肺组织细胞的凋亡情况。为了进一步探讨肺组织细胞凋亡的分子机制，进一步检测肺组织中f a s 蛋白的表达情况。另外，l p s 组和利多卡因+ l p s 组分别取1 5 只大鼠，比较两组大鼠4 8h 生存率。结果与生理盐水组相比，l p s 组大鼠肺组织湿干重比( p o 0 1 ) 以及f a s蛋白的表达显著增加( p o 0 5 ) 。病理切片显示肺组织呈现典型的a l i 的表现。t u n e l 染色则观察到大量肺组织细胞的凋亡，凋亡的肺组织细胞从形态学上观察，以肺泡上皮细胞为主。l p s 组大鼠的4 8h 病死率高达4 6 7 。与l p s 组相比，相同时间点的利多卡因+ l p s 组中，肺组织湿干重比( 尸 o 0 1 ) 以及f a s 蛋白的表达明显降低( p o 0 5 ) ，a l i 的程度明显减轻。同时凋亡的肺组织细胞数目明显减少。大鼠的病死率也降低到2 6 7 ( 尸 0 0 5 ) 。结论利多卡因预处理，明显减轻l p s 引起的a l i 程度，肺组织细胞凋亡的数目明显减少，大鼠生存率得到明显改善。利多卡因的抗凋亡作用可能与其抑制肺组织中f a s 蛋白的表达有关。关键词急性肺损伤；凋亡；利多卡因20徐州医学院硕士学位论丈t h ee f f e c to fl i d o c a i n eo na p o p t o s i so fl u n gt i s s u ei na c u t el u n gi n j u r ya b s t r a c to b j e c t i v et oe x a m i n et h ea n t i a p o p t o s i se f f e c to fl i d o c a i n eo nl u n gt i s s u ei na c u t el u n gi n j u r y , a n dt oe x p l o r et h ep o s s i b l em e c h a n i s m m e t h o d sm a l es p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t sw e r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p sr a n d o m l yt h e yw e r es a l i n ec o n t r o lt r e a t e dg r o u p ( i 尚) ，l i d o c a i n ec o n t r o lt r e a t e dg r o u p( n ) ，l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) t r e a t e dg r o u p ( n = 6e a c h ) ，a n dl i d o c a i n e + l p st r e a t e dg r o u p ( n = 6e a c h ) ，r e s p e c t i v e l y a l lg r o u p sw e r es u b j e c t e di n t o6h ，1 2h ，a n d2 4hp o i n ts u b g r o u p sa f t e rl p sa d m i n s t r a t i o n ，e x c e p to fs a l i n ec o n t r o lt r e a t e dg r o u pa n dl i d o c a i n et r e a t e dc o n t r o lg r o u p t h el u n gw e t - t o d r ) ，w e i g h tr a t i oa n dt h eh i s t o p a t h o l o g i cc h a n g e so fl u n gt i s s u e sw e r ed e t e c t e d a n da p o p t o t i cc e l l sw e r es t a i n e db yt e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y it r a n s f e r a s e m e d i a t ed u t pn i c k e n dl a b e l i n g ( t u n e l ) t e c h n i q u e t oe x p l o r et h er e l a t e dm o l e c u l a rm e c h a n i s m ，t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e lo ff a si nl u n gt i s s u ew a se x a m i n e db yw e s t e mb l o t f u r t h e r , t oc o n f i r mt h er o l eo fl i d o c a i n ei nt h i sm o d e l ，t h em o r t a l i t yo fr a t si nl p sg r o u pv sl i d o c a i n e + l p sg r o u pw a sc o m p a r e d r e s u l t sl u n gw e t t o - d r yw e i g h tr a t i ow a ss i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e da f t e rl p sa d m i n i s t r a t i o n h es t a i no fl u n gt i s s u es h o w e de d e m a ( b o t hi n t e r s t i t i a la n da l v e o l a r )a n dn e u t r o p h i l si n f i l t r a t i o ni na l v e o l a rt i s s u e a l v e o l a rs p a c e sw e r en a r r o w e da n de r y t h r o c y t e se x u d e d w h e nt h et i s s u es e c t i o n sw e r el a b e l e dw i t ha ni ns i t ut u n e la s s a yt od e t e c ta p o p t o t i cc e l l si nl u n g s ，n ot u n e l p o s i t i v ec e l l sw e r eo b s e r v e di ns a l i n ec o n t r o lt r e a t e dg r o u pa n dl i d o c a i n ec o n t r l ot r e a t e dg r o u p i n d u c t i o no fs e p s i sb yl p sr e s u l t e di nam a r k e da p p e a r a n c eo ft u n e l p o s i t i v ec e l l s t h ee x p r e s s i o no ff a sw a ss u b s t a n t i a l l yi n c r e a s e d p r e t r e a t m e n tw i t hl i d o c a i n e ，t h ea p o p t o s i so fa l v e o l a rw a l lc e l l sw a sr e d u c e d w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dl i d o c a i n ei n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no ff a si nl u n gt i s s u e c o n c l u s i o nl i d o c a i n ea t t e n u a t e sl p s i n d u c e da c u t el u n gi n j u r ya n dr e d u c e sa l v e o l a rw a l lc e l l sa p o p t o s i s f a sm i g h tp l a ya l le s s e n t i a lr o l ei nr e g u l a t i o no fl p s i n d u c e da c u t el u n gi n j u r y k e yw o r d sa c u t el u n gi n j u r y ；a p o p t o s i s ；l i d o e a i n e3徐州医学院硕士学位论文静士剐百急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y , a l l ) 影响大约每1 0 万居民中的1 5 6 5 人。a l i 的病死率在3 2 一5 5 之_ f a j t l , 2 】。a l i v e ( a c u t el u n gi n j u r y v e r i f i c a t i o no f e p i d e m i o l o g y )的数据显示，a l i a r d s 影响大约7 的i c u 病人，并且5 4 的中度a l i 患者在2 4小时内发展为急性呼吸窘迫综合征( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 【3 1 。虽然对于a l i a r d s 的支持治疗有了很大的改进，但到目前为止，尚未有特异性的治疗措施。研究显示a l f a r d s 的本质是以炎症介质过度释放为特征的肺部广泛炎症反应，但是以消除炎症反应为目的的治疗效果并不十分理想。因此，为了使a l f a r d s 患者得到更好的治疗，对a l f a r d s 发展过程中的主要机制进行进一步的研究仍然是必要的。近年来研究显示，细胞凋亡在a l f a r d s 的发病机制中起到重要作用h ，5 6 1 。刘元生等【7 】人认为在a l i 发生发展过程中，肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞是最早受损的靶细胞，过去长期认为靶细胞死亡方式为坏死，近年来研究表明炎症介质和致炎因素可对细胞凋亡产生影响。l ix 等【8 1 人的研究也表明凋亡失调导致肺血管内皮细胞以及上皮细胞损伤是a l f a r d s 的本质。细胞凋亡是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身程序，自己结束生命的过程。它广泛参与机体的新陈代谢、分化增殖、清除受损及突变细胞等重要过程，对于机体稳定和生长发育具有重要意义。细胞凋亡是一个主动的、高度有序的过程。在基因水平是基因程控的，在分子水平由一系列凋亡相关酶参与控制。细胞凋亡可以通过两种途径实现：外源性死亡受体途径和内源性线粒体介导的途径，两种途径最终汇合成一个共同的途径导致效应者c a s p a s e s 家族的激活【9 1 。死亡受体家族属于肿瘤坏死因子家族( t u m o rn e c r o s i sf a r n i l y , t n f ) ，它转导细胞外的死亡配体信号。死亡受体是一个膜受体家族，也称为t n f 受体，它包含六个家族成员：t n f r 1 ，f a s ，d r 3 ，d r 4 ，d r 5 ，d r 6 。与配体结合后，死亡受体通过死亡效应4徐州医学院硕士学位论文序列介导的亲同种抗原的相互作用来募集f a s 相关死亡结构域( f a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n ，f a d d ) 。接下来，f a d d 进一步募集p r o c a s p a s e8 。死亡受体，f a d d ，p r o c a s p a s e s8 共同组成死亡诱导信号复合体( d e a t hi n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) 。d i s c 形成后，p r o c a s p a s e8 转变为c a s p a s e8 ，c a s p a s e8 反过来进一步促进和激活了c a s p a s e s 级联通路【1 0 1 1 ，1 2 ，13 1 。内源性死亡信号通路是通过线粒体释放细胞色素c 等物质来发挥作用的。但是，目前在关于内源性和外源性通路最终结合是一个被广泛接受的观点【1 4 】。利多卡因作为传统的局麻药和抗心律失常药物，广泛应用于临床。已有研究证实利多卡因具有抗炎作用，并且在剂量为4m g k g 。时抗炎作用最为显著【15 1 。利多卡因在大鼠脑【1 6 1 和心肌【1 7 1 的缺血再灌注过程中具有抗凋亡的作用。徐道妙等【1 引人应用体外培养的肺泡i i 型上皮细胞证实，利多卡因对l p s 引起的肺泡i i 型上皮细胞的凋亡和坏死有直接的抑制作用。但在体状态下，利多卡因对l p s 诱导的a l i 模型中肺组织细胞凋亡的影响国内外鲜有报道。本研究通过观察抗炎剂量利多卡因对l p s 所致的大鼠肺组织细胞凋亡的影响，为临床应用利多卡因防治a l i a r d s 提供依据，并对利多卡因在a l i a r d s 中抗凋亡作用的分子机制进行初步探讨。士学位论文方法1 材料1 1 动物：雄性s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠，2 0 0 - - 2 5 0g ，由中国科学院上海实验动物中心提供。1 2 主要试剂l p s ( e c o l i ，0 5 5 ：0 5 )美国s i g m a 公司t u n e l 试剂盒( p o d )德国( r o c h e ) 诊断试剂公司f a s ( g 9 ) ( s o 7 4 5 4 0 )美国s a n t ac r u z利多卡因上海第二军医大学朝晖制药厂彩色预染蛋白分子量标准中国碧云天生物技术研究所b c a 蛋白浓度测定试剂盒中国碧云天生物技术研究所s d s p a g e 凝胶配制试剂盒中国碧云天生物技术研究所胞浆蛋白与胞膜蛋白提取试剂盒中国碧云天生物技术研究所w e s t e r n 一抗体稀释液中国碧云天生物技术研究所w e s t e r n 二抗体稀释液中国碧云天生物技术研究所p m s f ( 1 0 0m m )中国碧云天生物技术研究所甘氨酸上海生工生物工程技术服务有限公司s d s上海生工生物工程技术服务有限公司t r i s上海生工生物工程技术服务有限公司t w e e n 2 0上海生工生物工程技术服务有限公司n b t b c i p 显色试剂盒上海p r o m e g a 公司戊巴比妥钠中国医药集团上海公司甲醇上海化学试剂厂甲醛上海化学试剂厂6徐州医学院硕士学位论文n c 膜牛血清白蛋白( 组分v )小鼠抗1 3 - a c t i n 单克隆抗体碱磷酶标记马抗小鼠l g gc i t r a t e 柠檬酸盐缓冲液其他常用试剂均为国产分析纯1 3 主要仪器及设备电动匀浆器恒温箱酶标仪水浴箱高速离心机电子天平超低温冰箱显微镜电泳槽转膜槽电泳仪电源t s 1 型脱色摇床组织匀浆机微量进样器p h y - i i i 病理组织漂烘仪病理组织包埋冰冻台b m j i i i 型恒温干燥箱漩涡混合器7a m e r s h a m 公司美国a m r e s c o 公司中国中杉金桥生物公司中国中杉金桥生物公司中国中杉金桥生物公司美国g l a s c o l 公司中国上海美国b i o r a d 公司中国上海美国b e c k m a n 公司瑞士m e t - t i e r 公司日本s a n y o 公司日本o l y m p u s 公司美国b i o b a d 公司美国b i o b a d 公司美国b i o b a d 公司江苏海门市麒麟医用仪器厂德国中国上海常州中威电子仪器有限公司常州中威电子仪器有限公司上海精密实验设备有限公司江苏海门市麒麟医用仪器厂徐州医学院硕士学位论文恒温培养箱1 4 主要溶液配方1 4 1电泳缓冲液( p h8 3 )g l yt r i s h c ls d s双蒸水1 4 2 电转缓冲液( p h8 3 )g l y ir i s h c lc h 3 0 h双蒸水1 4 3 洗膜液( p h7 5 )n a c lt r i s h c l双蒸水1 4 4p b s ( p h7 4 )n a c lk c ln a 2 h p 0 4 12 h 2 0k h 2 p 0 41 8 8g3 0g1 0g至1 0 0 0m l1 4 4g3 0g2 0 0 m l至1 0 0 0m l5 8 4g1 2 1g1m l至1 0 0 0m l8 0g0 2g2 9g0 2g8上海跃进医疗器械厂徐州医学院硕士学位论文洗膜液1 4 60 0 1m 柠檬酸盐缓冲液柠檬酸三钠柠檬酸双蒸水1 4 7 福尔马林溶液至8 0 0m l5g1 0 0 m l3g0 4g至1 0 0 0m l甲醛1 0 0m lp b s 溶液至1 0 0 0m l2 方法2 1 模型制备和分组雄性s d 大鼠4 8 只，随机分为4 组t 生理盐水组( n _ 6 ) ，经尾静脉注射生理盐水；l p s 组( n = 1 8 ) ，经尾静脉注射l p s5m g k g 1 ；利多卡因+l p s 组( n = 1 8 ) ，在经尾静脉注射l p s 前1 0m i n 经尾静脉注射4m g k g 。1 的利多卡因；利多卡因组( n = 6 ) ，经尾静脉注射4m g k g 1 利多卡因。本实验中所选择的药物剂量以及给药方式参照文献【1 5 ，1 9 1 以及我们预实验的结果。2 2 生存率分析为了证实利多卡因对a l i 大鼠生存率的影响，l p s 组，利多卡因+ l p s 组分别取1 5 只大鼠进行4 8h 生存率的分析。2 3 肺组织病理学改变开胸后取大鼠右肺中叶，浸泡于中性福尔马林溶液中固定，然后用石蜡包埋制成蜡块。5g m 的厚度制成石蜡切片，经过苏木素伊红( h e )染色，在光镜下观察肺组织病理学变化。2 4t u n e l 凋亡检测肺组织细胞凋亡检测应用脱氧核苷酸末端转移酶介导的9徐州医学院硕士学位论文缺口末端标记( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y it r a n s f e r a s e m e d i a t ed u t pn i c k - e n dl a b e l i n g ，t u 悒l ) 技术。具体步骤如下：2 4 1 切片：将制好的蜡块放置在病理组织包埋冰冻台上，冰冻数分钟后，将蜡块放置在切片机上，并将石蜡切片机的切片厚度设置成5l a m ，切片，选取比较完整的切片置于漂片仪中，将摊平的切片置于防脱片上，注意勿使切片重叠，以保证观察效果。在烘漂仪的烘烤处烘烤2h ，然后放置在3 7 c 的抗体孵育箱中过夜。2 4 2 标本预处理：切片置于二甲苯中2 0m i n ，然后换入新鲜二甲苯2 0m i n ，无水酒精洗两次，每次3r a i n ，9 5 和9 0 酒精各洗一次，每次3m i n ，蒸馏水洗两次，每次3m i n 。2 4 - 3 抗原修复：c i t r a t e 柠檬酸盐缓冲液，用双蒸水溶解，调节p h 值至6 0 ，然后稀释到1 0 0 0m l ，柠檬酸盐缓冲液的最终浓度为0 0 1m 0 1 1 。将切片放置在抗原修复盒中，倒入配好的柠檬酸盐缓冲液，抗原修复液的量以没过防脱片中的肺组织为宜。将抗原修复盒置于微波炉中，高火2m i n ，低火8m i n ，进行抗原修复。抗原修复结束后将抗原修复盒取出，打开抗原修复盒的盖子，室温下自然冷却，大约需要4 0 m i n 。2 4 4t u n e l 反应液的配制：将5 0 i _ t l 酶液( t d t ) 移入4 5 0 肛1 标记液( 荧光素标记的核苷酸) 。每5 0 0 1 x lt u n e l 反应液设计用于1 0 份标本，反应液应于用前配制，并置于冰上备用。2 4 5 染色步骤：将组织切片从抗原修复液中取出，置于湿盒中，磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds m i n e ，p b s ) 冲洗，2 次，每次3r a i n标记：将防脱片甩干滴加5 0 “1t u n e l 反应液，置于暗盒中，3 7 c 孵育3 0m i np b s 冲洗3 次，每次3m i n ，将防脱片甩干加p o d 液覆盖肺组织，放入暗盒中，3 7 c 孵育3 0m i np b s 冲洗3 次，每次3m i n配置d a b 显色液：1m l 双蒸水中滴加d a b 试剂1 ，2 ，3 各一滴，避光保存l o徐州医学院硕士学位论文将防脱片甩干，滴加d a b 显色液显微镜下观察，待切片中细胞核变色即可显色结束，用自来水冲洗苏木素复染1r a i n ，蒸馏水充分冲洗盐酸酒精处理1s脱蜡水化：依次用7 0 、9 5 、1 0 0 酒精脱水、干燥，二甲苯5m i n ，二甲苯5m i n ，二甲苯2 0 5 0s ，然后自来水冲洗中性树胶封片2 4 6 镜检：t u n e l 阳性细胞细胞核呈棕褐色，阴性细胞细胞核为蓝色。在高倍镜下观察细胞的凋亡情况。2 5 肺湿干重比开胸后取部分右肺上叶，称量其重量，放置在恒温烤箱中直至重量不再减少为止，再次称量肺组织的重量，并且计算肺组织湿干重比( 肺组织湿干重比= 肺组织湿重肺组织干重) 。2 6 蛋白质印迹分析( w e s t e r nb l o t )免疫印迹( w e s t e r nb l o t ) 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。是将分离的蛋白质转移到固相载体( 例如硝酸纤维素薄膜) 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。在注射l p s 后6h ，1 2h ，2 4h ，开胸取出大鼠右肺下叶，迅速冻存于液氮中备用。2 6 1 胞浆蛋白和胞膜蛋白的提取2 6 1 1组织样品的准备：取约1 0 0m g 肺组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1m l 临用前添加了p m s f 的膜蛋白提取试剂a ，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置l 啦1 5m i n 。2 6 1 2 组织匀浆：把组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，进行州医学院硕士学位论文细胞：4 c ，7 0 0g 离心1 0r a i n ，小心收集上清液至吸取上清时切勿接触沉淀。以保证吸取的上清液2 6 1 4 沉淀细胞膜碎片：4 c ，1 4 0 0 0g ，离心3 0m i n ，以沉淀细胞膜碎片。2 6 1 5 收集细胞胞浆蛋白：吸取上清即为胞浆蛋白，可7 0 c 保存备用。吸取上清时可以有3 0 5 0 “l 上清残留，以避免接触沉淀导致上清样品被污染。2 6 1 6 抽提膜蛋白：4 c ，1 4 0 0 0g 离心1 0s ，尽最大努力吸取上清，可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走少量沉淀，加入膜蛋白抽提试剂盒b2 0 0 肛l ，最高速剧烈v o r t e x5s 重新沉淀，冰浴5 1 0m i n ，重复前述步骤的v o r t e x 和冰浴孵育1 2 次，以充分抽提膜蛋白。随后，1 4 0 0 0g 离心5m i n ，收集上清即为胞膜蛋白溶液，可一7 0 。c 保存备用。2 6 2 样本蛋白浓度的测定与配平2 6 2 1根据样品数量，按5 0 体积b c a 试剂a 加1 体积b c a 试剂b ( 5 0 ：1 ) 配制适量b c a 工作液，充分混匀。b c a 工作液室温2 4h 内稳定。2 6 2 2 完全溶解蛋白标准品，取1 0 “1 稀释至1 0 0g l ，使终浓度为o 5m g m l 。蛋白样品用胞浆蛋白和胞膜蛋白提取试剂盒中的a 盒或者b 盒中的溶液稀释。2 6 2 3 将标准品按0 ，1 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0 山加到9 6 孔板的标准品孔中，加用稀释标准品的溶液补足到2 0 “l 。2 6 2 4 加入3 肛l 样品到9 6 孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液稀释到2 0“l 。2 6 2 5 各孔加入2 0 01 t lb c a 工作液，3 7 放置3 0m i n 。2 6 2 6 用酶标仪测定蛋白吸光度值，根据蛋白吸光度值和蛋白浓度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样本蛋白浓度。2 6 2 7 将各组蛋白进行配平，稀释液与稀释标准品的溶液相同。2 6 3 蛋白变性按照每4p l 蛋白样品n a 1p ls d s p a g e 蛋白上样缓冲液( 5 x )1 2徐州医学院硕士学位论文比例混合，煮沸5m i n 。2 0 保存备用。2 6 4 电泳2 6 4 1 配胶根据配胶试剂盒说明书和蛋白k d 值大小，确定分离胶的浓度，将玻璃放置好后配制分离胶，本实验所测蛋白分子量在2 0 - 8 0k d 之间，故选择1 0 的分离胶。然后进行灌胶。分离胶凝固以后配制浓缩胶，灌胶结束后根据需要插入不同孑l 径的梳子。2 6 4 2 上样根据所测蛋白浓度，确定上样量，一般情况下3 0 - 1 0 01 t g 的蛋白量可显示比较清晰的条带。2 6 4 3电泳在样品蛋白未到分离胶时电压宜偏小，一般8 0m v 效果较好。到达分离胶后电压可适当调大。待目的蛋白分开后停止电泳。2 6 5 转膜采用半干转法将蛋白信息转移至硝酸纤维素( n c ) 膜上，转膜时间根据蛋白分子量决定。2 6 6 封闭转膜结束后，用洗膜液洗膜3 次，每次5m i n 。然后放入配制好的5 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 中，室温孵育2h 。2 6 7 一抗，二抗的结合封闭完成后分别加入目的蛋白的一抗4 。c 过夜。具体如下：抗f a s 抗体( 1 ：2 0 0 ) ，抗1 3 - a c t i n 抗体( 1 ：8 0 0 ) 。用洗膜液洗膜3 次，每次5m i n ，然后用相应的碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2h ，洗膜3 次，每次5m i n 。2 6 8 显色及扫描用n b t b c i p 碱性磷酸酶显色试剂盒显色。待n c 膜上条带清晰后，停止显色。扫描结果用图像分析仪( l a b w o r k ss o r w a r e ，u v pu p l a n d ，c a ，u s a ) 处理，数据进行半定量分析。2 7统计学分析数据以均数标准差表示，组间比较用单因素方差分析( a n o v a ) ，组间两两比较用q 检验，组内比较用t 检验。生存率分析采用k a p l a n m e i e r 检验。应用s p s s16 0 对数据进行统计学分析。徐州医学院硕士学位论文结果( 图3 ) 所示，l p s 处理后6h 可以观察到肺组织明显，肺间隔增宽，肺不张，大量炎性粒细胞以及红细胞渗出。而在利多卡因+ l p s 组，上述改变明显减轻。观察利多卡因组与生理盐水组发现，肺组织形态学无明显异常，炎性粒细胞以及红细胞仅有少量渗出。2 肺组织湿干重比的变化肺组织湿干重比结果如( 表1 ) 所示，与生理盐水组相比，l p s 各亚组肺组织湿干重比明显增加，差异有统计学意义( p o 0 1 ) ；利多卡因+ l p s 组，与相同时间点的l p s 组相比，肺组织湿干重比明显减少，差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。3 肺组织中f a s 的表达如( 图1 ) 所示，与生理盐水组相比，l p s 组三个亚组中可以观察到f a s 的表达在6h ，1 2h 两个亚组明显增加，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。其中f a s 的表达在l p s 处理后6h 达到高峰，然后逐渐下降。而利多卡因+ l p s 组，f a s 的表达明显减少，与相同时间点的l p s 组相比，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。由此可见，利多卡因预处理明显抑制了f a s 蛋白的表达。半定量分析见( 图2 ) 。4 肺组织细胞的凋亡应用原位标记的t u n e l 技术，检测凋亡的肺组织细胞。如图( 4 ) 所示，在生理盐水组以及利多卡因组几乎没有发现t u n e l 阳性的细胞，l p s 组可见t u n e l阳性的细胞数目明显增加。凋亡的细胞可以通过其形态确定主要为肺泡上皮细胞。利多卡因+ l p s 组t u n e l 阳性的细胞数目明显减少。5 生存率分析在l p s 组，大鼠4 8h 病死率为4 6 7 ，而利多卡因+ l p s 组大鼠4 8h 病死率降低为2 6 7 ( p o 0 5 ) ，生存曲线见( 图5 ) 。与l p s 组相比，利多卡因+ l p s 组1 4徐州医学院硕士学位论文大鼠病死率明显降低。利多卡因预处理提高了a l i 大鼠的生存率。徐州医学院硕士学位论文讨论尾静脉注射l p s6h 后，大鼠肺组织h e 染色切片可以观察到肺组织明显的充血水肿，肺泡结构破坏，肺间隔增宽，肺不张，炎性粒细胞以及红细胞大量渗出，这与l p s 诱导的a l l 的病理改变是一致的，说明本实验应用的大鼠a l l 的模型是成功的。研究证实利多卡因减少肺组织细胞的凋亡。与该研究类似，k a c z m a r e kd j 等【1 7 】人将大鼠冠状动脉结扎3 0m i n ，然后再灌注2 4h 制造心肌缺血再灌注模型。在缺血开始前单次给予利多卡因1m g k 9 1 ，然后在接下来的缺血过程中持续给予每小时0 6m g k g - 1 的利多卡因。研究发现利多卡因预处理能够减少心肌细胞的凋亡，具有明显的心肌保护作用。l e ib 等【1 5 1 人将大鼠大脑中动脉结扎9 0m i n 制造大鼠短暂局部脑缺血模型。利多卡因在缺血前3 0m i n 开始给予，初始剂量为1 5m g k 9 1 ，然后以每小时2m g k g 。的剂量持续给予1 8 0m i n 。研究显示，临床抗心律失常剂量的利多卡因减少局部脑缺血再灌注过程中中枢神经细胞的凋亡，利多卡因可以有效的应用在预防和治疗大鼠脑缺血再灌注损伤过程中。l e eh t 等例人以每小时2m g k g 。1 的剂量持续给予大鼠利多卡因6h ，然后进行3 0m i n 的肾脏缺血以及接下来的再灌注过程。研究证实，利多卡因的应用加重了肾脏缺血再灌注损伤的程度，并且认为这可能与利多卡因增加坏死，凋亡以及炎症反应有关。l e eh t 等人应用利多卡因的总量明显高于本实验以及k a c z m a r e kd j 和l e ib 等人在实验中的用量。并且利多卡因的用量明显高于临床常规用量，高剂量的利多卡因本身就可能会引起肾脏组织细胞的坏死或者凋亡。其次，肾脏为代谢器官，利多卡因的代谢要经过肾脏，肾功能障碍的患者利多卡因要慎用，因为药物代谢本身有可能会加重肾脏的损伤。综合以上两点，l e eh t 等人得出的利多卡因的促凋亡作用是具有剂量和器官局限性的，并不与本实验的研究结果相冲突。1 6徐州医学院硕士学位论文显微镜下观察发现，凋亡的肺组织细胞以肺泡上皮细胞为主。在a l i 过程中可以观察到肺泡上皮细胞f a s 蛋白表达增加【2 2 ，2 3 1 。体内外的研究已经证实【2 l 】，f a s蛋白的激活诱导了肺泡上皮细胞的凋亡，特别是远端肺泡上皮细胞对f a s 蛋白诱导的凋亡更加敏感。p e r lm 等2 4 】人的研究证实f a s 受体的缺乏明显降低了肺泡上皮细胞凋亡的程度。m ax 等【2 5 】人分离i i 型肺泡上皮细胞，用小干扰r n a 干扰f 嬲蛋白的表达，研究证实，f a s 蛋白表达沉默后明显降低l p s 所致的细胞凋亡和炎性细胞因子的释放。m a t s u d an 等( 2 6 】人应用双重免疫荧光技术显示，在a l i 过程中，f a s 蛋白的表达主要集中在肺泡上皮细胞中。以上研究证实，f a s 蛋白在肺泡上皮细胞的凋亡中起到重要的作用。那么利多卡因是不是通过抑制f a s 蛋白的表达来发挥其抗凋亡作用的呢? 为了进一步研究利多卡因抗凋亡的分子机制，进一步检测了肺组织中f a s 蛋白的表达情况，与预想的结果一致，利多卡因预处理明显降低f a s 蛋白的表达。也就是说利多卡因可能是通过抑制f a s 蛋白的表达来发挥抗凋亡作用的。本实验应用的利多卡因剂量为4m g k g 1 ，在此剂量时利多卡因能够发挥最佳的抗炎作用，并且证实是通过抑制n f r , b 的激活实现的。本实验的目的是观察抗炎剂量的利多卡因能否发挥抗凋亡作用，因此利多卡因是单次给药。但是4m g k g 1的利多卡因是不是最佳的抗凋亡剂量则需要进一步的证实。k a c z m a r e kd j 等人证实利多卡因的应用，并没有减少心肌缺血再灌注过程中多形核白细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u c o c y t e ，p m n ) 到梗死区域的募集。因此，利多卡因对心肌缺血再灌注的保护作用是通过抗凋亡而非抗炎途径介导的。本研究证实，利多卡因可以明显减少肺组织细胞的凋亡，并且进一步证实这种抗凋亡作用是通过抑制f a s 蛋白的表达来发挥作用的。但是，利多卡因本身还具有抗炎的作用。因此虽然证实利卡因预处理能够明显降低a l i 大鼠的病死率，但是，并没有将利多卡因的抗炎作用排除在外，因此，只能说明利多卡因预处理可以改善a l i 大鼠的生存率，并不能证实这是单纯的由利多卡因的抗凋亡发挥的作用。综上所述，利多卡因的预处理能够明显减轻l p s 所致的大鼠a u 程度，减少1 7徐州医学院硕士学位论文肺组织细胞的凋亡，改善l p s 诱导的a l i 大鼠的生存率。这种抗凋亡作用是通过抑制肺组织f a s 蛋白的表达而发挥作用的。徐州医学院硕士学位论文结论在本实验条件下1 利多卡因明显减轻l p s 诱导的a u 程度，改善a u 大鼠的生存率。2 利多卡因通过抑制f a s 蛋白的表达来抑制肺组织细胞的凋亡。1 9徐州医学院硕士学位论文论文图片ab lb 2b 3c ic 2c 3dg a s1 3 - a c t i n图lf a s 蛋白的表达a ，生理盐水组：b 1 ，l p s 6 h 组；b 2 ，l p s1 2 h 组；b 3 ，l p s2 4 h 组；c l ，利多卡因+ l p s 6h 组；c 2 ，利多卡因+ l p s1 2h 组；c 3 ，利多卡因+ l p s2 4h 组；d ，利多卡因组。f i g 1l p si n d u c e sf a se x p r e s s i o ni nl u n gt i s s u e sa ，c o n t r o lg r o u p ；b ，l p sg r o u p ；c ，l i d o c a i n e + l p sg r o u p ；d ，l i d o c a i n eg r o u p 43 5= 2 2=8=2= i 30 5of a s 蛋白半定量分析结果“#；ll。；ji嚣：f；誊上，生上：i生ii；t；。lt：，l上鏖flj；i；ll；。#1 ，；，i ；。c o n t r o l6 h1 2 h2 4 hl i d o c a i n e图2 肺组织中f a s 蛋白的表达水平( w e s t e r n 印迹)注：与生理盐水组相比，群p 0 0 5 ；同一时间点与l p s 组相比，p 0 0 5 。f i g 2e x p r e s s i o no ff a sp r o t e i n si nt h er a tl u n g ( w e s t e r nb l o t )r e p r e s e n t a t i v e so f3t oi n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s d a t aa r ee x p r e s s e da sm e a n 士s 群p 0 0 5v ss a l i n eg r o u p 掌p 0 0 5v sl p sg r o u p 面五五i 面一 l i d o c a i n eg r o u pi 口l p sg r o u pl 口ii d o c a i n e + l p sg r o u l徐州医学院硕士学位论文图3 注射l p s6h 后肺组织病理改变结果( h e 染色x 4 0 0 )a ，生理盐水t g ：b ，l p s 组；c ，利多卡因+ l p s 组；d ，利多卡因组。f i g 3m i c r o s c o p i cf i n d i n g so fl u n gt i s s u e ss t a i n e dw i t hh c m a t o x y l i n - e o s i n ( h - e x 4 0 0 )h i s t o p a t h o l o g i ce x a m i n a t i o no f t h el u n g sw a sp e r f o r m e da t6ha f t e rl p si n j e c t i o n a ，s a l i n eg r o u p ；b ，l p sg r o u p ；c ，l i d o c a i n e + l p sg r o u p ；d ，l i d o c a i n eg r o u p 2 1徐州医学院硕士学位论文图4 注射l p s1 2h 后肺组织细胞的凋亡( x 4 0 0 ) ( 细胞核棕褐色的细胞为凋亡的细胞)a ，生理盐水组；b ，l p s 组；c ，利多卡因+ l p s 组；d ，利多卡因组f i g 4m i c r o s c o p i cf i n d i n g so fl u n gt i s s u e ss t a i n e dw i t ht u n e l ( x 4 0 0 )h i s t o p a t h o l o g i ce x a m i n a t i o no f t h el u n g sw a sp e r