（药物化学专业论文）糖修饰卟啉和酞菁类近红外荧光分子探针研究.pdf

独创性声明 m i l l i i l l l l i i i f l l i i i i l i f f | l i i 咖 y 17 7 5 7 2 6 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字同期：年月r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解一j 篓塞坯塑医堂瞳有关保存、使用学位论文的管理办 法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权j 量宝逊塑匡堂医可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字同期：年月同签字同期：年月同 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 目 录 第一章前言1 1 1 分子影像学l 1 2 光学成像2 1 2 1 荧光成像2 1 2 2 生物体臼发光成像3 1 2 3 光学成像的优势及局限性。3 1 3 光学探针3 1 3 1 光学探针的分类3 1 3 1 1 非特异探针5 1 3 1 2 靶向探针5 1 3 13 智能探针5 1 3 2 内源性荧光团5 1 3 3 外源性荧光团5 1 3 。4 近红外荧光分子探针6 1 3 4 1 近红外仡青染料6 1 3 4 2 近红外最子点荧光探针7 1 3 4 3 近红外稀l ：配合物荧光探针8 1 3 4 4 含四吡略基团的近红外荧光染料8 1 3 4 5 噻嗪类和嗯嗪类近红外荧光染料9 1 4 课题的提出9 第二章糖卟啉的合成1 l 2 1 实验仪器与试剂，1 2 2 1 1 实验试剂1 2 2 1 2 实验仪器。1 2 2 2 糖炔修饰卟啉及糖修饰卟啉的合成。1 3 2 2 1 化合物i i 7 的合成1 4 2 2 2 化合物i i 8 的合成1 4 2 3 化合物i i 一9 的合成1 5 2 2 4 化合物i i 1l 的合成1 5 2 2 5 化合物i i 1 的合成1 6 2 2 6 化合物i i 2 的合成1 7 2 2 7 化合物i i 1 3 的合成1 7 2 2 8 化合物i i 2 ，i i 3 i i _ 4 的合成1 8 2 2 9 化合物i i 1 4 的合成19 2 3 结果与讨论1 9 2 4 本章小结2 0 第三章糖酞菁的合成 3 1 实验仪器与试剂。2 3 3 1 1 实验试剂2 3 3 3 目标物结构通式2 5 3 3 1 化合物i i i 一5 的合成2 6 3 3 2 化合物i i i 8 的合成2 6 3 3 3 化合物i i i 1 l 的合成2 7 3 3 4 化合物i i i 1 2 的合成2 7 3 3 5 化合物i i i 1 的合成2 8 3 3 6 化合物i i i 一1 4 的合成2 9 3 3 7 化合物i l i 2 的合成3 0 3 4 结果与讨论3 0 3 5 本章小结3 l 第四章糖修饰酞菁近红外荧光探针光学性质及活体成像评价3 2 4 1 实验仪器及试剂3 2 4 2 糖修饰酞菁光学性质评价一3 2 4 2 1 酞菁化合物紫外光谱测定3 2 4 2 2 酞菁化合物荧光景子产牢的测定3 2 4 2 3 光漂门实验( p h 0 1 o b l e a c h l n ge x p e r i m e n t s ) 3 3 4 3 葡萄糖酞菁及乳糖酞菁作为荧光探针在动物及组织成像r f l 的应用3 3 4 3 1 小门鼠肝癌模犁组织成像3 3 4 3 1 1 鼠原性肝癌肿瘤模犁的建立3 3 4 3 1 2 小广1 鼠肝癌模型组织成像3 4 4 3 2 裸鼠活体预成像实验3 4 4 3 3 裸鼠肝癌肿瘤模犁活体及组织成像3 4 4 3 3 1 裸鼠肝癌肿瘤模犁的建立3 4 4 3 3 2 裸鼠肝癌肿瘤模掣活体成像3 4 4 。3 3 3 裸鼠肝癌肿瘤模型组织成像3 5 4 4 数据统计学分析3 5 4 5 结果与讨论3 5 4 5 1 糖修饰酞菁光学性质评价3 5 4 5 2 小自鼠肝癌模掣组织成像3 9 4 5 3 裸鼠活体顸成像实验4 0 4 5 4 裸鼠肝癌肿瘤模犁活体成像结果4 l 4 5 5 裸鼠肝癌肿瘤模犁组织成像结果4 l 4 6 本章小结4 2 第五章结论 参考文献4 4 附图 致谢 l 中文摘要 分子影像学通过跟踪活体内生物大分子或代谢过程的特征揭示分子水平上生 理和病理机制，可以完成疾病的早期诊断、定性定量、预后评估等。光学成像具有 非离子低能量辐射、高敏感性、连续实时监测、无创性或微创性、设备价格相对廉 价等优势，特别是近红外荧光成像具有很好的应用前景。由于生物体对近红外荧光 的光散射非常弱，因而背景干扰降低，灵敏度提高，近红外光穿透生物组织的距离 较大，因此采用近红外荧光成像可以对深层的组织和器官进行探测和成像，在分子 成像方面具有其特定的优势。 分子影像的核心是分子探针，但是目前光学分子探针还有待进一步优化和完 善，主要应解决的问题包括分子探针在深层次光的传输和采集高的发光量子效率等 性能，以及良好的生物相容性和靶向性等。本文以含四吡咯基团的荧光染料( 包括 卟啉和酞菁) 作为荧光基团丌展用于生物组织成像的近红外荧光探针研究。由于卟 啉或酞菁分子，其在近红外区域有较强的吸收和高的荧光量子产量以及光学稳定 性，且其发光效率与发光波长，以及单线态、三线态的比例和特征可以通过周边基 团或中心元素的修饰而得以调控，可以满足探针的近红外光学特性；糖的修饰能够 改善探针的溶解性和生物相容性，而且利用糖的肿瘤靶向功能可以提高探针肿瘤主 动靶向成像效果。因而我们综合了卟啉或酞菁的光学特性以及糖的特性，设计合成 了糖基取代的卟啉类和酞菁类两个体系的近红外荧光探针化合物，并对其进行评 价。 糖修饰卟啉是以三甲基硅丙炔醛、糖醛、糖二吡咯、甲醛二吡咯等作为中问体 分别合成了糖炔卟啉，两个糖基、三个糖基以及四个糖基卟啉，并以此为前体通 过偶联反应制备了在近红外区具有强吸收的卟啉体系。糖修饰酞菁以c l i c k 反应为 连接策略，以炔基苯二甲腈和叠氮糖为前体，通过端基炔和叠氮的c l i c k 反应形成 了以三唑环为l i n k e r 的糖修饰苯二甲腈，以此中问体合成葡萄糖酞菁和乳糖酞菁， 所有化合物均通过质谱、核磁等结构表征。基于光谱分析法我们证明了糖酞菁光稳 定性好和荧光量子产率高。我们以糖修饰酞菁作为近红外荧光探针，以肝癌肿瘤鼠 为动物模型，通过活体荧光成像研究探针在各脏器的聚集、分布以及成像效果。结 果表明该类体系具有良好近红外荧光特性、水溶性和一定的肿瘤靶向性，该光学探 针在肿瘤诊断中具有很好的应用前景。 关键词：分子影像荧光探针近红外糖 酞菁卟啉 a b s t r a c t m o l e c u l a ri m a 舀n gi nv i v oc a nd i s p l a yt h eb i o l o 百c a lp r o c e s s e sa tt h ec e l l u l a ra n d m o l e c u l a rl e v e l ，r e v e a l t h em e c h a n i s mo fp h y s i 0 1 0 9 i c a la n dp a t h o l o 百c a lp r o c e s s e s ，a n d p r o v i d e e f r e c t i v em e t h o d so f d e t e c t i n g a n dt r a c k i n gt h ed i s e a s e st i i e a t m e n t s i t s a p p l i c a t i o n si n c l u d et h ee a r l yc l i n i c a ld i s e a s ed i a 印o s i s ，q u a l i t a t i v ea n dq u a l l t i t a t i v e e v a l u a t i o nc u r a t i v ee 行e c ta n ds oo n o p t i c a l i m a g i n gh a sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha s n o n i o n i c l o w - e n e 唱yr a d i a t i o n ，h i 曲 s e n s i t i v i t y c o n t i n u o u sr e a l - t i m e m o n i t o n n g ， n o n i n v a s i v eo rm i n i m a l l yi n v a s i v e ，r e l a t i v e l yi n e x p e n s i v ee q u i p m e n ta n dl o wp r i c e p a n i c u l 砌y n e a r - i n 仔a r e dn u o r e s c e n c ei m a g i n gh a sab e t t e r 印p l i c a t i o np m s p e c t a st h e o r g a n i s m sh a v el o ws c a t t 鲥n ge 艉c ta n db a c k g r o u n di n t e r f e r e n c ei nn e a r i n 仔a r e dr e 酉o n ， t h i si n c r e a s e sn e a r - i n 仔a r e di m a g es e n s i t i v i t ya n dp e n e t r a t i n gd e p t hi nb i o l o 酉c a lt i s s u e s on e a r _ i n 行a r e df l u o r e s c e n c ei m a g i n gc a i lb eu s e di n d e 印t i s s u e sa n do r g a n s f o r d e t e c t i o na n di m a g i n go w n i n gt oi t ss p e c i f i ca d v a n t a g e s t h ec o r ee l e m e n to fm o l e c u l a ri m a 西n gi sm o l e c u l a rp r o b e ，b u tc u l l r e n t o p t i c a l m o l e c u l a rp r o b e sc a nn o tm e e tt h ep r a c t i c a ln e e d ，如n h e ro p t i m i z a t i o ni sr e q u i r e dt o i m p r o v et h e i rp r o p e n i e s ，i n c l u d i n gl i 曲tt r a n s m i s s i o ni nd 印t ha n dt h el 啪i n e s c e n c e q u a n t u me m c i e n c y ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n dt a r g e t i n ga b i l i t y i nt h i sp a p e r n u o r e s c e n t d y e sw i t hf o u rp y r r o l em o i e t i e s ( i n c l u d i n gp o r p h 蜘n sa n dp h t h a l o c y a n i n e s ) w e r es t u d i e d a sn e a r - i n 仔a r e dn u o r e s c e n tp r o b e sf o rb i o l o 西c a lt i s s u ei m a g i n g e i t h e rp o 印h 州no r p h t h a l o c y a n i n e ，t h e i r l u m i n e s c e n c ee m c i e n c y e m i s s i o nw a v e l e n 舀ha sw e l la st h es i n g l e t a 1 1 dt r i p l e ts t a t ec h a r a c t e r i s t i c sc o u i db em o n i t o r e db yt h es u b s t i t u e n ta tp 甜p h e 巧a n d c o r ee l e i n e n t sd o p i n g ，a n dt h e yh a v eg o o do p t i c a ls t a b i l i t yi nn e a r i n 仔a r e dr e 百o n s u g a r m o d i f i c a t i o nc a nn o to n l yi m p r o v et h es u b s t r a t es o l u b i l i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y b u ta l s o i n c r e a s et l l m o rt a r g e t i n g 如n c t i o no fi m a 百n gp r o b e s h e r en e a r - i n f r a r e dn u o r e s c e n t p m b e sw e r ed e s i 朗e dt om e e tm o l e c u l a rp r o b e s 如n c t i o na n di m p r o v ei m a g i n ge f f e c t sb y c o m b i n i n gp o 叩h 巾n o rp h t h a l o c y a n i n ew i t hs u g a r s u g a ra i l da l k y i l y lm o d i f i e dp o r p h y r i nw i t h 觚o ，t h r e ea 1 1 df o u rs a c c h 撕d em o i e t i e s w a s s ”t h e s i z e db y c o n d e n s a t i o no fi n t e 肌e d i a t e s t m e t h y l s i l y lp r o p ”a l ， s u g a r - m o d i f i e da l d e h y d e ， s u g a r - m o d i f i e dd i p y i t o l er e s p e c t i v e l y ：s u g a rd e c o r a t e d p h t h a l o c y a n i n ew a ss y n t h e s i z e db yc o n d e n s a t i o no fi t ss a c c h a r i d ep r e c u r s o r s u g a r m o d i f i e db e l l z e n ed i c a r b o n i t r i l e ，w h i c hi sa c h i e v e db yr e a c t i o no fs a c c h 撕d ea z i d ew i t h a l k y n y lm o d i f i e db e n z e n ed i c a r b o n i t r i l et h f o u 曲c l i c kr e a c t i o n b a s e do nt h i sa p p r o a c h ， w es y l l t h e s i z e d 西u c o s ea 1 1 di a c t o s ed e c o r a t e dp h t h a l o c y a n i n e s a l lo fc o m p o u n d sw e r e c h a r a c t 嘶z e db ym a s ss p e c t r o m e t n u c l e a rm a 印e t i cr e s o n a n c es p e c t m ma n ds 0o n t h e i rl i g h ts t a b i l i t ya n df l u o r e s c e n c eq u a n t u m 妒e l dw e r ee v a l u a t e db ys p e c t r o s c o p i c m e t h o d r e s u l t ss h o wt h e yh a v eg o o d 叩t i c a ls t a b i l i t ya n dh i 曲e m i s s i o na b i l i t yi nn i r r e 舀o n d 印r o t e c t i o ni ns u g a rr e s u l t si ns o l u b i l i t ye n h a i l c e m e n ti na q u e o u ss o l u t i o n w b s e l e c t e dm o d i f i e ds u g a rp h t h a l o c y a n i n ea sp r o b ef o ra n i m a l i m a g i n gi nv i v o m i c ew i t h l i v e rc a n c e rw e r eu s e da sa n i m a lm o d e la j l da s s e s s e db yi nv i v of l u o r e s c e n c ei m a g i n gt o e v a l u a t en e 孙i n 疗a r e di m a 百n ge 腩c ta n do 唱a 1 1a g 伊e g a t i o na i l dd i s t 曲u t i o no fp r o b ei n v i v o t h er e s u l t sp r o v e dt h a ts u g a rm o d i f i e dp h t h a l o c y a n i n eh a v eo b v i o u si m a 西n ge 虢c t a n dac e r t a i nt u m o r t a 唱e t i n ga b i l i 够s ot h en e a ri n 行a r e do p t i c a lp r o b ec a nb ea p p l i e di n m ed i a g n o s i so fc a n c e ri nf h t u r e k e y w o r d s ： m o l e c u l a r i m a 百n g ， f 1 u o r e s c e n c e p r o b e ， n e a r j n 行a r e d ， s u g a r ， p h t h a l o c y a n i n e s ，p o 印h 如n 北京协和医学院硕十学位论文 第一章前言 1 1 分子影像学 1 9 9 9 年美国哈佛大学w e i s s l e d e r 等最早提出分子影像学的概念，即应用影像学 方法，在细胞和分子水平上对活体状态下的牛物过程进行定性和定量研究 1 】，它提 供了相关的生物学信息去特征化和检测体内分子水平的牛理学过程。疾病的诊断通 常是基于生理学上的变化，而这种牛理学上的变化是疾病状况下分子变化的延迟显 示，因此这些分子变化的影像能够提供早期的疾病诊断。另外，量化的疾病区域揭 示了疾病的变化，它提供了效验检测的手段，成功的外科手术切除依赖于疾病组织 的精确定位，疾病组织细胞的成像可潜在的用于改善临床结果。 由于分子影像的重要性，这个多学科交叉的领域现在在牛物学路径，药理学机 制，以及疾病过程方面增添了新维度的理解。用外源性的靶向探针，研究者能够实 施在细胞和活体系统上的非侵入性研究以及基因表达的显现，牛化反应，信号转换， 调整路径，整个有机体内的直接药物行为【2 】。分子影像学策略主要涉及到四个方面 的问题：( 1 ) 是否存在疾病相关的分子靶标；( 2 ) 当选定一个分子靶标之后，是否有一 个能够与其高亲和力结合的分子探针；( 3 ) 这个分子探针是否能够穿越生物体传递屏 障，像血管，空隙，细胞膜等；( 4 ) 敏感，快速，高分辨率的成像技术。常用的分子 影像技术有正电子发射断层显像( p e t ) ，单光子发射计算机断层显像( s p e c t ) ，磁共 振显像( m r i ) ，光学显像，超声( u s ) 以及计算机断层扫描( c t ) 。每种显像技术在灵 敏度、空间以及瞬时清晰度、对比度、成本等方面各有自己的优势和劣势 ( t a b l e l 1 ) 【3 - 5 】 表1 1 成像模式比较( t a b l e l 1 c o m p a n s o no f i m a g i n gm o d a 蚴e s ) 分辨率 模式灵敏度成本空间时间对比 m r i l o _ l u mm s p e t 4 5 唧m i n s p e c t & 1 2 m mm i o p u 翰i l - 2 咖m s u s 5 0 u mm s e c c t 5 0 - 1 0 0 u ms 幸，高；，中；f 氐 北京协和医学院硕士学位论文 高灵敏度是核成像的首要条件，尤其是正电子发射断层显像( p e t ) ，它比单光 子发射计算机断层显像( s p e c t ) 更加灵敏，主要的限制因素是低空间分辨率和高成 本。磁共振成像( m r i ) 有高空间分辨率，但是它的检测需要高浓度的影像试剂( 灵敏 度低) 。光学影像有高灵敏度以及能提供强反差的图像，但是组织渗透有限。超声 对于造影剂检测来说非常灵敏，但是要达到这些造影剂充分的稳定性仍然具有挑战 性。另外，超声的高空间分辨率明显减小了成像深度。c t 的局限性在于低灵敏度以 及致电离辐射的副作用。通过以上比较可以看出光学成像无论在灵敏度，对比度， 时间空间分辨率等方面均可以很好的满足成像要求，具有广泛的应用价值。 1 2 光学成像 由于在牛物医学研究和临床治疗上的需求，以及光学成像具有非离子低能量辐 射、高敏感性、连续实时监测、无创性或微创性、设备价格相对廉价等优势，光学 分子成像在牛物组织成像的应用方面发展迅猛。 1 2 1 荧光成像 恤l 董 l ， l i ， b iu ， 伽i v v h l t e 口卜l 图1 1 生物组织不同光学区域的吸收及荧光( a 生物组织吸收光谱b 生物组织解剖图像c 可见 光激发生物组织图像d 近红外光激发生物组织图像) f i g u r e l 1p h o t oa b s o 叩t i o no f b i o l o 百c a lt i s s u ea n dn u o r e s c e n c e ( a a b s o 叩t i o ns p e c n l l mo f b i 0 1 0 9 i c a l t i s s u eb a m t o 觚c a l i 眦g eo f b i o l o 百c a l t i s s u e c i 嘲g eo fv i s i b l el i g h te x c i t e db i o l o g i c a l t i s s u e d i i m g eo fn e a r - i n f h r e dl i g h te x c i t e db i o l o 百c a lt i s s u e ) 光学成像是基于荧光或者牛物体之发光，荧光是吸收光子之后紧接着一个长波 长的发射【引。但以近红外荧光成像技术的研究最为瞩目，牛物组织对可见区 ( 3 5 0 7 0 0 n m ) 和红外区( 1 0 0 0 n m ) 具有最强的吸收，而在近红外荧光区域 ( 6 5 0 一1 0 0 0 n m ) 牛物样品基体光吸收或荧光强度都很小( 图1 1 ) ，生物体对近红外 q 鬻耋鼍 旧 滁瞅 北京协和医学院硕+ 学位论文 荧光的光散射也非常弱，因而背景干扰大大降低，灵敏度大大提高，近红外光可以 穿透生物组织的距离最大，因此采用近红外荧光成像可以对深层的组织和器官进行 探测和成像，在分子成像方面具有其特定的优势7 制。 1 2 2 生物体自发光成像 生物体之发光不需要吸收光，而是来自于化学能到光能的转化。在生物体之发 光中，荧光素酶催化虫荧光素的氧化，导致光子的释放【9 】，由于哺乳动物组织并不 自发荧光，生物体之发光仅在荧光素酶与荧光素反应时才发牛，生物体之发光的背 景信号是零并且具有高的信噪比【lo 】。自然界中存在各种各样的牛物体之发光试剂， 如雄性萤火虫的虫荧光素，以及海绵动物，珊瑚虫，水母，蛤蚌，其它类型鱼类的 虫荧光素【l l 】。萤火虫的虫荧光素在5 6 2 啪有发射并有着良好的量子产率( 9 0 ) 【1 2 】， 因此成为体内牛物体之发光成像的最常用底物1 3 j5 1 。 1 2 3 光学成像的优势以及局限性 光学成像在很多方面都具有优势，它有1 2 n 1 1 1 1 空间分辨率( 活体显微镜方法为 l u m ) ，以及纳摩尔级数的灵敏度【l 引。相比于其他的显像方法如m ，p e t ，s p e c t 以及u s ，仪器成本相对低廉。此外，一系列的影像探针以及信号放大系统也是可行 的【1 7 】。光学成像也允许多通道的成像用多重具有不同光谱性质的探针以及表面解剖 信息与分子信息的共同组合 1 8 】。 光学成像的局限是由于它的光学渗透性，以及组织吸收和自发荧光。这个局限 性可以用近红外荧光分子探针或者荧光分子x 线断层摄影术( f m t ) 来得到部分解 决。在f m t 中一个物件在一排发射器和探测器中旋转【l9 1 。空间记录的检测到的荧光， 随后被断层x 光摄影装置重建，产牛定量的三维图像，在f m t 中应用合适的荧光染 料理论上讲7 1 4 c m 的渗透深度是可以达到的【2 们。 光学分子影像技术存在的问题包括成像仪器设备的改进，数据采集信息和算法 的提高以及分子探针技术的优化，其中分子影像的核心是分子探针。但是目前光学 分子探针还有待进一步优化和完善，主要应解决的问题包括分子探针在深层次光的 传输和采集高的发光量子效率等性能，以及良好的生物相容性和靶向性等 2 心3 1 。 1 3 光学探针 1 3 1 光学探针的分类 分子探针是一种可以反映外在环境变化，得到跟踪研究目的的体系，它由特异 性结合部位和信号指示元素两部分构成，通过光谱、氧化还原电位或者其他物化行 北京协和医学院硕七学位论文 为的变化来跟踪体系的变化。分子探针可以是核素标记或荧光标记的探针体系。放 射成像体系( 如p e t 和s p e c t ) ，因其放射引起的副作用使得光学成像系统在临床医 学上受到人们的重视和研究。一个分子影像试剂特征化的含有一个信号基团，例如 放射性同位素，金属离子或者荧光基团；同时具有一个靶向功能，包括受体配基， 糖，酶底物，抗体以及蛋白。总而言之，影像试剂按其结合位点能够被归为三类： 非特异探针，靶向探针，智能探针，如下图所示 图1 2 ( a ) 非特异探针( b ) 靶向探针( c ) 智能探针 f i g u r e l 2( a ) n o i l s p e c i f i cp r o b e ( b ) n o n _ a c t i v a t a b l et a r g e t e dp r o b e ( c ) a c t i v a t a b l et a r g e t e dp r o b e 常用的近红外荧光团及成像策略( a ) 有机花青近红外荧光染料的化学结构通式， y = c ，o ，s 等，n = l 二碳花青；n _ 2 七甲川花青；r l 和l 也可以相似或者不同，他们 可以是烷基，磺烷基，环烷基，烷氧基或者芳基；r 3 和r 4 可以是磺烷基，卤烷基， 或者羟基羰基烷基化合物 2 4 彩1 ( b ) 活性探针靶向细胞表面受体，靶标细胞上的特定细 胞标识( 紫色) 与它的配体( 黄色) 结合，配体上键合有一个荧光团( 红色) 2 6 1 ( c ) 酶活化的 近红外荧光探针，在没有靶标蛋白酶存在时，荧光团( 棕色) 由于另外一个荧光分子 紧密拥挤而发牛淬灭，在蛋白酶的存在下，缩氨酸底物被切断释放出荧光团并产生 荧光【2 7 】 4 北京协和医学院硕i ：学位论文 1 3 1 1 非特异探针 通常是小分子的游离荧光基团，经血管裂隙分布于细胞外组织中。由于病变和 正常组织的灌注率或血管通透性不同，这样非特异性探针进入病变组织和证常组织 的数量明显不同，进行近红外荧光成像时病理学改变就以可视的光学图像展现出来 【2 8 】，此种探针的缺点是缺乏特异性，并且成像时背景荧光干扰大。 1 3 1 2 靶向探针 近红外荧光基团与特异性配体结合构成探针，这些探针无论其是否与靶点结合 均可检测到其信号，因此信噪比较低，需要经一段时间后，自由分布的探针从血液 循环中清除，仅留下与靶点结合的探针时其信噪比才可能有所增加，可用于显示某 一分子的结构与分布【2 9 】，此种探针的应用受到靶点浓度和活性的限制，又与多余靶 向探针的清除率有关。 1 3 1 3 智能探针 其在原始注射状态几乎无信号，一旦为不同机制( 物理或生化机制) 激活可在 作用位点产生强烈的信号改变及高的信噪比，从而可由先进的影像学设备检测到这 些信号改变的分子探针，主要用于定位酶的活性与功能【1 4 】。此种探针的稳定性和特 异性明显优于先前所述的两种探针。以对肿瘤基质金属蛋白酶活性的近红外荧光成 像为例，应用聚左旋赖氨酸链为运载体，将近红外荧光染料通过酶特异性底物共价 键结合其上。此时未被激活探针的荧光信号是检测不到的，但是基质金属蛋白酶切 断近红外荧光染料与运载体之间的共价键之后荧光染料被释放，施行近红外成像时 可探测到明亮的荧光信掣3 0 1 。 1 3 2 内源性荧光团 内源性和外源性的试剂均被开发来进行光学成像，均含有荧光团来吸收光能然 后在一个长波长发射荧光，几种已知的内源性组织荧光团包括烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸辅酶( n a d 【h 】) ，弹性蛋白，胶原质，以及黄素，四羟酮醇【3 1 3 2 1 。这些荧光团富集 和分布的变化被证实是与组织学上的变化相关联的【3 3 川。在作为一个有开发前景的 诊断工具时，由于低的信噪比( s n ) 使这些信号仅限于早期身体损害的检测，这种低 的信噪比源于一个相对低的信号( 在早期疾病中内源性荧光团的富集仅有很小的变 化可以被检测的到) 和一个强的背景( 散射光，反射光等) 。 1 3 3 外源性荧光团 由于内源性荧光团在早期疾病发现中的缺陷，外源性的荧光试剂现在得到了广 泛的关注，外源性的荧光试剂能够大体上被分为灌注型和靶向型试剂。灌注型试剂 北京协和医学院硕 ：学位论文 是非特异性的，通常为小的分子，通过渗透进入细胞外的空间进行血管分布。他们 通过区分组织肿瘤灌注速率或者血管渗漏加强了病理学上的对比。尽管如此，灌 注型试剂由于低的信噪比以及缺乏任何的特定分子信息限制了其在分子影像中的 应用【3 引。靶向荧光试剂通常具有靶向功能基，如受体配基，抗体以及缩氨酸，增加 了影像试剂在病变组织中的定位，减少了其在正常组织中的吸收。大多数的外源性 荧光试剂用荧光染料作为信号基团。一些经常使用的荧光染料包括荧光素，罗丹明 以及花青染料。 荧光素是一个绿色染料，它的激发波长在4 9 4 n m ，发射波长在5 2 1 m 。一个比 较知名的荧光素衍生物是异硫氰酸荧光素( f i t c ) ，异硫氰酸作为连接。荧光素染料 由于皮肤和内脏的绿色自身荧光，高血红蛋白吸收，强组织散射限制了其在光学成 像中的应用。罗丹明是指一系列的红色染料，例如丽丝胺罗丹明b 磺酰氯，它在甲 醇中的吸收波长为5 6 8 n m ，发射波长为5 8 3 m 。通过磺酰氯基团，这种罗丹明染料 能够很容易的结合特定配基。相比于荧光素染料，罗丹明染料吸收波长红移，能够 减少组织自发荧光，吸收和散射。尽管如此，丽丝胺染料用于体内成像也并不理想， 这是由于相比于近红外染料相对低的组织渗透。 1 3 4 近红外荧光分子探针 近红外荧光探针具有低能量辐射、高敏感性、组织穿透性强等优点，受到研究 者的广泛关注【3 6 1 。 1 3 4 1 近红外花青染料 图1 3 近红外花青染料 f i g u r e1 3n e a r - i n 舶r e dc y a n i n ed u e 花青染料是具有可调整光学性质和高消光系数光学成像试剂的著名代表之一， 吸收和发射在可见到近红外区域内变动3 7 ，3 8 1 ，同时，花青染料能够与靶向配基结合， 给予了分子特异性。现在已经有一些商品化的花青染料，如吲哚花青绿( i c g ) ，c y 5 ， 6 北京协和医学院帧l j 学位论文 c y 5 5 ，c y 7 ，i r d y e t m 7 0 0 d x ，i r d y e t m 8 0 0 r s 以及i r d y e t m 8 0 0 c w 。 图1 4i c g 及i r d y c 丌8 0 0 c wn h se s t e r 的结构 f i g u r e1 4s t n l c t u r eo fi c g a i l di r d y e t m 8 0 0 c wn h se s t e r i c g ( f i g u r e l 4 ) 是一个被临床证实的灌注型花青染料，它除仅一个己知的副反应( 稀 有的过敏性反应) 外在人体内具有非常低的毒性【3 9 】。i c g 在临床上应用了很多年来检 测肝脏功能【矧，心脏生理学，以及眼科学中的荧光血管造影术【4 2 1 。另外用i c g 进 行肿瘤成像被证明有部分可行性【4 3 舯】。最近出现了几种改进的七甲吲哚菁染料， f i g u r e l 6 显例，i r d y e 丌8 0 0 c wn h s 酯( l i c o rb i o s c i e i l c e s ，l i n c o l n ，n e ) ，这个分 子比起i c g 的两个磺酸基来说有四个磺酸基，增加了水溶性以及水溶液量子产率， 此外n h s 醚键能够与靶向配基共价结合。其中以花菁染料c y 5 5 为代表的探针体系 获得了较好的应用【4 5 1 ，由于其合成相当复杂，价格极其昂贵。 1 3 4 2 近红外量子点荧光探针 量子点的经典合成是在高温有机溶剂中含有一个无机内核以及无机金属外壳， 半导体量子点( q d s ) 有着吸引人的光学和电学性质。相比于有机荧光团，量子点有 几个特殊的优势：( 1 ) 量子点能够抵御不可逆转的光氧化光漂白，而有机荧光团对于 环境敏感能够进行光漂白：( 2 ) 量子点的发射波长通过改变体积和组成能够很容易的 实现从蓝光到近红外光的跨越；( 3 ) 量子点由于高的摩尔消光系数因此提高了亮度； ( 4 ) 由于宽的激发光谱以及窄的发射轮廓，量子点能够被单光源激发并发出不同颜色 的光，使得多色彩标记成为可能【4 6 钠】。然而，由于疏水表面，多数量子点在成像研 究方面遇到了生物相容性的挑战【5 0 】，一些水溶性的量子点被丌发出来，但是它们中 的大多数受限于降低的量子效率，聚合，高成本以及不稳定性【5 1 1 。 7 北京协和医学院硕i ：学位论文 图1 5 量子点 f i g u r e1 5q u a n t l l md o t s 1 3 4 3 近红外稀土配合物荧光探针 稀土配合物荧光探针主要是e u 和t b 的配合物荧光探针，目前主要应用于生物 技术及时问分辨荧光检测技术上，近年来研究者也进行了稀土配合物荧光探针生物 组织成像的相关研究5 2 1 ，但稀土配合物难以进行功能修饰对其应用产生了一定的限 制。 1 3 4 4 含四吡咯基团的近红外荧光染料 图1 6 酞菁类化合物的结构 f i g u r e1 6 i h es n l l c t u r e so fp h t h a l o c y a n i n ec o m p o u n d s 酞菁类化合物由四个吡咯单元通过四个氮原子连接起来，形成一个大的共轭体 系。酞菁类化合物在7 5 0 9 0 0 n m 处具有强烈的吸收，此类探针有一尖锐的q - b