胶体金培训.pptx

胶体金快速检测卡的工艺流程及产品简介,技术部赵灿,胶体金标记技术的相关定义,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种成熟的免疫标记技术。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。,胶体金技术的发展DevelopmentofImmunecolloidalgoldtechnique,1939-雏形Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法,胶体金技术的种类及优点,快速免疫金渗滤法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒,免疫层析法(immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。,免疫胶体金技术的特点,优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染。GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。,成为目前“病人身边检验”（point-of-caretesting，POCT）中广为应用的方法。,不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。,主要内容,1.胶体金的结构及性质,1.1胶体金的概念胶体金：指的是粒径在1100nm之间能够均匀、稳定地、分散在液体中的金纳米颗粒，因其水溶液呈胶体状，因此称之为胶体金溶液。,1.胶体金的结构及性质,1.2胶体金的结构胶体金是由一个基础金原子核与包围在外层的负离子层（AuCl2-）构成，呈球形(小颗粒)或椭圆形(大颗粒)。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子，能够均匀的分散在溶液中。,1.胶体金的结构及性质,1.3胶体金的性质（1）外观：随着胶体金粒径的逐渐增大，胶体金溶液的颜色从橙色逐渐变为紫色。,（2）特性：由于胶体金表面呈负电性，能够与表面带正电荷的蛋白（抗原、抗体）通过静电作用结合进行标记。,2.胶体金的制备,2.1制备方法（还原法）：采用还原剂将氯金酸（HAuC14）还原成胶体金，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。,柠檬酸钠,加热煮沸,氯金酸（HAuC14）,胶体金溶液,2.胶体金的制备,2.2注意事项：（1）玻璃器皿的清洁制金前，玻璃器皿必须干净，清洁剂洗涤1次，自来水冲洗3次，纯化水冲洗3次。,胶体金溶液澄清透亮，颜色均一，无异物、无漂金现象。,2.胶体金的制备,（2）试剂的配制制备胶体金需要配制的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液必需使用纯化水最好使用双蒸水。氯金酸溶液可以存放在4冰箱中，保存1年左右。还原剂柠檬酸三钠溶液需要新鲜配制。,3.胶体金检测卡的组成,3.1结构：主要由样品垫、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜），吸水垫4个部分组成，从下至上依次首尾互相衔接，粘贴在PVC底板上。,3.胶体金检测卡的组成,3.2作用：样品垫：检测样本滴加位置，对检测样本具有一定的过滤和缓冲作用，降低样本中离子强度或者酸碱度对检测结果的干扰。金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体与抗原的反应。硝酸纤维素膜：膜上预先包被上检测线和质控线，能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在检测线发生聚集，根据检测线的显色状况进行判读结果。吸水垫：通过吸水作用使液体样品向上流动，带动金垫上的金标抗体向上移动，从而与检测线的抗原发生反应。,3.胶体金检测卡的组成,3.胶体金检测卡的组成,3.3制作过程（1）胶体金的制备将氯金酸加热煮沸，用柠檬酸三钠还原制成所需粒径的胶体金溶液。,胶体金溶液澄清透亮，颜色均一，无异物、无漂金现象。,3.胶体金检测卡的组成,（2）胶体金的标记,0.2mol/LK2CO3,适量抗体,BSA或PEG,12000转/分,封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物,将胶体金标记物沉淀,将胶体金标记物重新溶解,3.胶体金检测卡的组成,（3）金垫制备将标记好的金标复合物浸润在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37将其烘干。（4）样品垫制备将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37将其烘干。,3.胶体金检测卡的组成,（5）反应模板制备将硝酸纤维素膜（NC膜）贴在PVC底板上，将点膜机机的C,T线调整到合适的距离，然后进行喷（划）线，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37将其烘干。,3.胶体金检测卡的组成,（6）组板将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与划好C,T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板相应的位置。,组装好的大板,3.胶体金检测卡的组成,（7）切条根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条，裁切宽度均一，无压痕，无划伤。,3.胶体金检测卡的组成,（8）包装将裁切好的检测条压入检测卡壳内，配上吸管和干燥剂装入铝箔袋内，并密封好，按照一定的规格装入包装盒内。,4.胶体金检测卡的原理,4.胶体金检测卡的原理,4.1竞争法,Y1:Hb单克隆抗体T:Hb2抗体Y2:羊抗鼠抗体,预先在硝酸纤维素膜上的检测线（T）和质控线（C）分别包被上血红蛋白单抗Hb2和羊抗鼠，将胶体金标记血红蛋白Hb1免疫鼠抗体并固着在玻璃纤维上制成金垫，组装成试纸条。将检测的粪便稀释液滴加在样品垫上，当稀释样品中血红蛋白达到一定的浓度时，即于固着在载体上的胶体金标记抗体结合，从而阻止其与固着在检测线（T）的抗体结合，在检测区形成紫红色条带。若样品稀释液中不血红蛋白，不与检测区的抗体结合，不在检测线（T）形成紫红色条带。样品和金标记复合物继续往上移动，在质控线（C）上与包被的羊抗鼠结合，在质控线（C）上形成一条紫红色条带，证明本检测卡有效。无论稀释样品中是否含有血红蛋白在质控线（C）均应出现一条紫红色条带。,结果判定：,阳性:检测线(T)与质控线(C)都出现，表明样品中含有血红蛋白的浓度高于检测限。阴性:只有质控线(C),无检测线(T)，表明样品中血红蛋白的浓度低于检测限。无效:在质控线（C）处，无紫红色条带出现，判定为试纸条无效。,血吸虫检测试剂盒渗滤法,2.产品优缺点优点：较免疫层析方法的检测，其制备流程较简单，无需干燥金垫等耗时过程。其灵敏度较免疫层析高，检测结果更加可靠。缺点：一人份所需原料较高，其成本是免疫层析法的10倍左右。其制备过程中，吸水垫为面纸，其剪裁较为耗时耗力。无单人份产品，对终端用户使用造成不便，无法一次性用完，其不当保存会对产品质量造成巨大影响，从而导致一些问题。,疟原虫检测试剂盒,重