流式细胞术在临床科研中的应用ppt课件.ppt

基于流式细胞术的单细胞分析在临床及科研中的应用,1,(一)流式细胞术的概念流式细胞术(flowcytometry,FCM)是利用流式细胞仪对生物颗粒包括细胞(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板等)、微生物以及人工合成微球的多种物理和生物学特性进行定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。,一、流式细胞术的基本原理,2,(二)FCM的工作原理1.荧光染色(1)用荧光染料直接染色，如：PI(2)用荧光抗体间接染色，FITC,PE2.液流技术：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。3.激光技术：散射光信号(FS、SS)荧光信号(FL1、FL2、FL3、FL4)4.数据处理,3,FlowCell,4,Laser,FluorescenceDetectors,5,PMT,PMT,PMT,PMT4,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,FlowCytometryPrinciple,Laser,1,2,3,4,Flowcell,525BP,575BP,620BP,675BP,6,7,流式细胞仪检测平台的独特之处,单细胞为检测单位速度快（100000细胞/秒）灵敏度高（具有1/10000）多色标记-多种信息能够同时检测细胞表型，功能，蛋白表达，磷酸化现象等，是细胞研究中唯一可以多角度，深层次剖析细胞的工具,特异、灵敏、多元化、高速、客观、省时,8,肿瘤学应用（1）-DNA及细胞周期分析,DNA含量测定解析细胞周期细胞增殖动力学变化,早期诊断探讨化疗药物的作用机制，化疗药物选择放疗强度、时间决定评估疗效判断预后和转移,9,肿瘤学应用（2）-膜抗原分析,造血系统肿瘤的分型肿瘤基因表达产物多药耐药性基因的表达产物肿瘤相关抗原激素受体淋巴细胞亚群其它与癌细胞生物行为有关因子,10,肿瘤学应用（3）细胞凋亡分析,DNA单染色，发现细胞凋亡峰（Ap峰，Apoptosis），坏死及其它原因引起的细胞碎片形成不规则的峰形，位于Ap峰与G1峰之间。AnnexinV荧光标记，与磷酯酰丝氨酸（细胞凋亡早期从膜内暴露到膜外）结合，FCM检测。多色分析，荧光探针标记DNA和蛋白质。,11,肿瘤的临床应用,细胞周期和倍体分析淋巴细胞及其亚群白血病免疫分型及残留,12,DNA细胞周期分析与临床应用,细胞周期,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,13,利用特殊的荧光染料与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量，解析细胞周期。,细胞DNA分析原理,14,DNA检测常用荧光染料,355nm或375nm：Hoechst33342、DAPI、DyeCycleViolet488nm：PI、7-AAD、DyeCycleGreen、DyeCycleOrange、633nm：DRAQ5,-FCM在肿瘤学中的应用主要是DNA和抗体标记-DNA标记主要是488nm激发的PI-抗体标记则主要是488nm激发的FITC、PE、PC5、PC7等染料,15,DNA细胞周期分析参数,DNA倍体性Ploidy细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数（DI）测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性S期含量SPFS期细胞占总周期细胞的比例CVG0/G1期细胞DNA含量变异系数,16,DNA的倍体和DNA指数的关系,17,FCM在肿瘤学中的应用-血液标本,肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的粘附分子检查ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD106,18,FCM在肿瘤学中的应用-脱落细胞,DNA分析,尿液宫颈分泌物胸腹水肺泡灌洗液各种刺激液食道镜钳取的活检组织支气管镜钳取的活检组织等,19,倍体检测,转移性癌良性反应性增生,20,赵XX淋巴结细针穿刺DNA出现异陪体，CD45阴性，几乎所有标记都是阴性（转移性癌）,21,颜XX淋巴结细针穿刺非霍奇金淋巴瘤（弥漫大B细胞型）AnnArbor分期IIIA期、IPI评分高危组,22,DNA含量的表示,细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数（DNAindex，DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0。DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/（正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数）,23,对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。,24,王XX超声内镜下胆总管下段刷检涂片（病理诊断：见癌细胞，倾向腺癌）,25,周XX肺泡灌洗液（右上肺腺癌大小1.8*1.0cm),26,费XX尿液病理高度可疑癌细胞（左肾盂尿路上皮癌，低分化,大小3cm3cm），,27,蒋XX淋巴结（右肺癌伴颈部淋巴结，肝内转移,可能为大细胞神经内分泌癌或分化差癌伴神经内分泌分化）,28,王XX腹水（妇科腹膜间皮瘤）,29,手术切除的乳腺肿块,30,DNA细胞周期分析临床意义,DNA诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰S期细胞含量10-15%DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在淋巴瘤病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,31,DNA细胞周期分析临床意义,DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，转移率预后差。近二倍体和二倍体肿瘤预后好，少数肿瘤的DNA分析对预后无判断价值。高S期肿瘤一般比低S期对化疗敏感。S期比率与肿瘤组织学分级密切相关：肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤,32,DNA细胞周期分析临床意义,监测病情与药效：流式细胞术可精确检测药物对肿瘤细胞的作用，研究肿瘤化疗药物的选择，制定合理的化疗方案，并随时监测病情发展和治疗效果，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。脱落细胞DNA分析:细胞抽吸物、体液、组织液、灌洗液脱落细胞的DNA分析。,33,肿瘤细胞SPF(S期含量),肿瘤细胞(单克隆)(14.18%),正常骨髓细胞(2.93%),肿瘤细胞(多克隆)(28.52%),34,免疫功能检测,35,淋巴细胞亚群分析,36,激活T淋巴细胞:CD3+CD25+CD3+HLA-DR+CD3+CD69+诱导性T淋巴细胞：CD3+CD4+CD45RA+抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+CD28-细胞毒性T淋巴细胞：CD3+CD8+CD28+记忆T淋巴细胞：CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+未活化T淋巴细胞：CD3+CD4+CD45RA+CD45RO-,淋巴细胞亚群分析,37,流式蛋白定量技术的应用（ApplicationofCytometricBeadArray）,38,正常人体内的Th1类细胞因子（IFN-、TNF-、IL-2）与Th2类细胞因子（IL-10、IL-5、IL-4）保持着相对的平衡。当这种平衡被打破也预示着疾病的发生，肿瘤的发生也伴随着Th1/Th2的转归与变化。由于细胞因子功能的多效性与细胞因子之间存在相互影响与转化，单个细胞因子的变化难以清楚的判断与肿瘤发生发展的关系，Th1/Th2的分类使肿瘤细胞免疫学的概念清晰化，近年来研究Th1/Th2两类细胞因子的漂移方向逐渐成为热点。,Th1/Th2漂移,39,CBA简介,CytometricBeadArray单个样本，同时定量液相中多种蛋白浓度抗原抗体反应原理基于流式细胞仪平台,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。,CaptureBead,CaptureAb,Bead,+,+,Analyteofinterest,FluorescentdetectionAb,40,1,2,3,不同强度红色荧光的捕获微球，在FCMFL3检测,不同的目标蛋白,PE标记的检测抗体，在FCMFL2检测。荧光强度即为靶蛋白量,4,5,6,CBA检测原理,41,CytometricBeadArray(CBA),+,BeadIntensityFL3(670LP),DetectorAbIntensityFL2(585/42BP),42,CBA与ELISA比较,分析可溶性蛋白定量分析结果高灵敏度,ELISA抗原检测的经典方法单项检测每项实验样本用量50-200L酶-底物背景干扰CV10-20%,BDCBA流式细胞仪自动检测多参数同时检测样本用量少50L操作方便，节省时间标准曲线自动测定，专用软件自动计算无酶-底物背景干扰提高检测效率CV5-12%,相似点,区别,43,CBA应用领域,血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测信